Способ количественного определения N-нитрозаминов в детских кашах

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения N-нитрозаминов (N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина) в продуктах питания, в частности в детских кашах, как молочных, так и простых.

Нитрозамины обладают широким спектром токсического действия на организм человека. В первую очередь их токсичность направлена на печень и почки, в результате чего происходит нарушение их функции и некрозы. При хранении пищевых продуктов происходит существенное повышение концентрации некоторых аминов, что может служить признаком их порчи. В связи с вышеизложенным для решения проблемы канцерогенной безопасности пищи необходимо усовершенствовать пищевые технологии, предупреждающие образование канцерогенных нитрозаминов в продуктах питания, особенно, детских, а также обеспечить их надежный контроль.

Известен способ определения N-нитрозаминов в жидкой и воздушной среде (Авт. свид-во СССР №1343316) путем обработки их химическими реагентами в среде уксусной кислоты с последующим измерением оптической плотности полученного окрашенного раствора, причем обработку проводят последовательно амальгамой цинка, содержащей 1,5-2% цинка, раствором гидроокиси натрия и спиртовым раствором альдегида бензольного или азотсодержащего гетероциклического ряда.

Недостатками указанного известного способа является следующие:

- спектрофотометрический метод является неселективным;

- другие азотсодержащие соединения будут мешать определению нитрозаминов, а следовательно невозможно достичь необходимой точности определения для реальной оценки содержания нитрозаминов в пробах.

Из уровня техники также известен способ хроматографического определения летучих аминов и нитрозаминов в пищевых продуктах (Авт. свид-во СССР №1259187), включающий экстракцию их, отгонку растворителя, растворение остатка в соляной кислоте, деление на нескольких аликвотных частей, при этом обрабатывают их, кроме одной, щелочью до рН 8-14, упаривают досуха и растворяют с последующим использованием раствора необработанной части в качестве анализируемого, а растворов щелочных частей - в качестве стандартных после добавления к ним стандартных соединений.

Однако при упаривании пробы возможны потери нитрозаминов, т.к. они являются высоколетучими соединениями, что существенно будет влиять на надежность и точность получаемого результата.

В статье (http://www.medved.kiev.ua/arh_nutr/art_2004/n04_2_12.htm) «К вопросу об определении n-нитрозаминов в пищевых продуктах», авторы: О.С. Зульфигаров, В.В. Юрченко и др., Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, Киев, Украина, также указано на то, что первым этапом определения нитрозаминов является их выделение из анализируемых продуктов. Невысокие температуры кипения (меньше 200°С) и достаточная термическая стабильность нитрозаминов обусловили возможность применения для их выделения отгонки с водяным паром. Простота в исполнении, универсальность по отношению к самым разным пищевым продуктам, полнота извлечения обусловили наиболее широкое применение этого подхода. Затем из водных отгонов нитрозамины выделяют методом экстракции, наилучшим экстрагентом для этого оказался хлористый метилен, который и находит наибольшее применение. Данная схема выделения эффективна как для жидких проб, так и для твердых. Далее рекомендуется проводить дериватизацию соответствующих вторичных аминов 4-нитрофенилдиазонием. Полученные при этом производные достаточно гидрофобны и легко могут быть сконцентрированы, а затем разделены методом обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сущность данного известного метода заключается в том, что неподвижная фаза - это неполярная (гидрофобные силикагели с привитыми группами С4, С8, С18 и др.) фаза; подвижная фаза - полярная (смеси воды и полярных растворителей: ацетонитрила, метанола, тетрагидрофурана и др.) фаза. Удерживание веществ растет с увеличением их гидрофобности (неполярности). Чем больше содержание органического растворителя, тем выше элюирующая способность подвижной фазы). Поскольку нитрофенилтриазены хорошо окрашены, чувствительность их детектирования на обычных, наиболее распространенных фотометрических детекторах достаточно высока и составляет 2⋅10^-7 моль/л. Это позволяет определять нитрозамины в пищевых продуктах при их содержании на порядок ниже ПДК. Важным обстоятельством является возможность применения данной методики для определения соответствующих вторичных аминов. Однако и этот способ не лишен недостатков, т.к.

1) много операций подготовки пробы к химическому анализу - перегонка с водяным паром затем экстракция органическим растворителем и получение производных нитрозаминов (дериватизация). Возможны большие потери целевых аналитов на этапах пробоподготовки, если нитрозамины в пробе содержатся в ультрамикроконцентрациях. Как результат, достаточно сложно получить достоверные данные по количественному содержанию нитрозаминов в пробе.

2) длительность проведения в серийных исследованиях, соэкстрагирование большого количества мешающих веществ, невысокая эффективность извлечения.

Госкомсанэпиднадзором России в 1993 г. была утверждена методика МУК 4.4.1.011-93 «Определение летучих N-нитрозаминов в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Методические указания по методам контроля. - М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1993. - 16 с., которая выбрана в качестве наиболее близкого аналога к предлагаемому изобретению. Согласно этой Методике проводят пробоподготовку, согласно которой к пробе добавляют сульфат натрия и сульфат алюминия в массовом соотношении 1:1, далее подкисляют до рН 3 сульфаминовой и серной кислотой, добавляют гексановый раствор нитрозодипропиламина, далее производят дистилляцию путем перегонки с помощью водяного пара с получением дистиллята пробы. Дистиллят переносят в делительную воронку и нитрозамины экстрагируют свежеперегнанным хлористым метиленом 4-5 раз по 15 мл. Объединенные хлорметиленовые экстракты высушивают прокаленным сульфатом магния, отфильтровывают, осушитель промывают небольшим объемом хлористого метилена, объединенные фильтраты помещают в круглодонную колбу на 100-150 мл, снабжают дефлегматором (или воздушным холодильником), помещают в водяную баню и упаривают хлористый метилен до 5-7 мл выдерживанием при температуре бани 55-65°С. Выполняют определение N-нитрозаминов с помощью газохроматографического анализа.

Однако указанная Методика МУК 4.4.1.011-93. позволяет выполнять либо полуколичественный анализ (флуориметрический метод), либо количественное определение модифицированных нитрозаминов с помощью хемилюминисцентного (термоэнергетического) детектора. При выполнении процедуры дериватизации возможны потери целевых аналитов, если матрица обладает сорбционными свойствами, что существенно будет влиять на надежность и точность определения. Кроме того, эта Методика отличается многостадийностью их хроматографического разделения и при этом обеспечивается лишь полуколичественное определение нитрозаминов, нижний предел определения составляет 1 мкг/кг продукта.

Технический результат, достигаемый предлагаемым способом заключается в обеспечении точности и достоверности количественного определения N-нитрозаминов за счет высокой полноты их извлечения из пробы, при одновременном снижении нижнего предела определения N-нитрозаминов.

Поставленный технический результат достигается предлагаемым способом количественного определения N-нитрозаминов в детских кашах, включающим пробоподготовку, согласно которой к пробе добавляют сульфат натрия и сульфат алюминия в массовом соотношении 1:1, далее подкисляют до рН 3 сульфаминовой и серной кислотой, производят дистилляцию путем перегонки с помощью водяного пара с получением дистиллята пробы, определение N-нитрозаминов с помощью газохроматографического анализа, при этом новым является то, что перед проведением газохроматографического анализа полученный дистиллят подвергают твердофазной экстракции ТФЭ на приборе ТФЭ, содержащем угольный картридж, при которой вначале производят промывку хлористым метиленом картриджа прибора ТФЭ, пропускают через него этилацетат с его задержкой в течение 30 сек, далее производят промывку водой; затем загружают ранее полученный дистиллят пробы, производят сушку картриджа в течение 20 минут, осуществляют элюирование дистиллята пробы с картриджа хлористым метиленом и полученные элюенты анализируют хромато-масс-спектрометрическим методом, устанавливая по хроматограммам количественное содержание N-нитрозаминов: N-нитрозодиаметиламина и N-нитрозодиэтиламина, при этом при ТФЭ объемное соотношение хлористого метилена для промывки картриджа, этилацетата, воды, дистиллята пробы и хлористого метилена для элюирования составляет 1:1,25:1:35:2 соответственно.

Указанный технический результат достигается за счет следующего.

Известные приемы и способы пробоподготовки, такие как экстракция органическим растворителем, дистилляция с перегретым водяным паром, статический и динамический анализ равновесной паровой фазы (АРП) не позволяют достичь высокой полноты извлечения, а, следовательно, - необходимой точности определений для реальной оценки содержания нитрозаминов в пищевых продуктах на уровне гигиенического норматива, указанного в СанПиН 2.3.2. 560-96 на продукты детского питания.

Благодаря использованию в предлагаемом способе операции твердофазной экстракции (далее - ТФЭ) при заявленных режимах и используемых реагентах и была обеспечена полнота извлечения нитрозаминов из пробы детской каши.

Традиционная процедура ТФЭ состоит из нескольких последовательных этапов и показана на примере прибора ТФЭ, приведенного на Фиг. 2:

1 - система Sepaths;

2 - (N2) емкости для органических растворителей;

3 - емкости для образцов;

4 - емкости для элюирования образцов с картриджа;

5 - рабочая платформа для картриджей;

6 - виала для сбора элюата.

С целью активации картриджа системы ТФЭ выполняется кондиционирование органическим растворителем, который поступает из емкостей 2 (показано на схеме), затем загрузка жидкого образца на картридж из емкости 3 с помощью азота. Во время этого, на сорбенте адсорбируются аналиты, а матрица идет в слив. На этой стадии сорбент удерживает целевые соединения до этапа элюирования. Мешающие компоненты пробы полностью удаляются на следующей стадии промывки картриджа органическим растворителем, который поступает из емкости 2. При этом интересующие аналиты элюируются сильным растворителем, поступающим из емкости 4 и элюат собирается в виалу 6.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом по трем этапам:

- пробоподготовка,

- выполнение ТФЭ,

- анализ полученных элюентов хромато-масс-спектрометрическим методом.

1. Пробоподготовка.

При открытии коробки каши, берут навеску каши массой 20-50 г, разбавляют водой объемом 100 мл и полученную пробу помещают в круглодонную колбу объемом 250 см³ для отгона.

Добавляют к ней высаливающие реагенты (5 г сульфата натрия и 5 г хлорида натрия).

Подкисляют 2,5 мл 2%-ным раствором сульфаминовой кислоты и 2,5 мл 1 н. серной кислотой до рН=3.

С помощью перегретого водяного пара при температуре парообразователя, равной 100±5°С, и температуре колбы с пробой, равной 80±5 С°, отгоняют 70 см дистиллята пробы.

2. Выполнение ТФЭ.

Вначале производят стадию кондиционирования - активацию угольного картриджа, для чего его промывают хлористым метиленом объемом 2 см³.

Затем через картридж пропускают растворитель - этилацетат, объемом 2,5 см³ с задержкой растворителя в течение 30 сек.

Для удаления остаточных количеств растворителей угольный картридж промывают водой объемом 2 см³.

Далее загружают ранее полученный дистиллят пробы объемом 70 см³ и производят сушку картриджа в течение 20 минут.

Осуществляют элюирование дистиллята пробы с картриджа хлористым метиленом объемом 4 см³.

При ТФЭ объемное соотношение хлористого метилена для промывки угольного картриджа, этилацетата, воды, дистиллята пробы и хлористого метилена для элюирования составляет 1:1,25:1:35:2 соответственно.

3. Анализ полученных элюентов хромато-масс-спектрометрическим методом.

Полученные элюенты анализируют известным хромато-масс-спектрометрическим методом, устанавливая по хроматограммам количественное содержание N-нитрозаминов: N-нитрозодиаметиламина и N-нитрозодиэтиламина. Этот метод наш (мы отрабатывали все параметры хромато-масс-спектрометрического метода для анализа нитрозаминов).

Отработка оптимальных хромато-масс-спектрометрических параметров определения летучих N-нитрозаминов в образцах каш осуществлялась с использованием газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ/МС): газовый хроматограф Agilent 7890А (USA) с масс-селективным детектором 5975С и квадрупольным масс-анализатором. Режим ионизации электронным ударом при 70 эВ.

В процессе экспериментальных исследований были изучены следующие капиллярные колонки различной длины и толщины пленки неподвижной фазы: DB-624, HP-FFAP, HP-Plot/U, HP-VOC. Качественное разделение N-нитрозаминов (N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина) с близкими физико-химическими свойствами было достигнуто на капиллярной колонке серии HP- FFAP 30 m ⋅ 0,250 mm ⋅ 0,250 μm длиной 30 метров, внутренним диаметром 0,250 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,250 μm. Режимы хромато-масс-спектрометрических параметров представлены в таблице 1.

Хроматограмма стандартного раствора N-нитрозаминов при оптимально подобранных условиях хромато-масс-спектрометрического анализа, зарегистрированная по полному ионному току, с содержанием N-нитрозаминов (С_НДМА=0,02 мкг/см³, С_НДЭА=0,02 мкг/см³) представлена на фиг. 1.

В режимах 2 и 3 (табл. 1) не наблюдалось достаточно эффективного разделения летучих N-нитрозаминов. Качественное разделение было достигнуто в режиме 1, который и был выбран для дальнейшей работы.

Для выбора оптимальных режимов и используемых реагентов предлагаемого способа были проведены лабораторные исследования по установлению необходимых марок картриджей в приборе ТФЭ, отработаны условия схем элюирования ТФЭ и дистилляции на стандартных образцах нитрозаминов, полученных путем построения градуировочной зависимости. Для построения градуировочной характеристики готовили серию растворов. Для этого применяли стандартные образцы.

Приготовление растворов для анализа

Приготовление раствора серной кислоты. В термостойкий химический стакан помещали 60 см³ бидистиллированной воды, при непрерывном помешивании приливали 29 см³ концентрированной серной кислоты. Раствор охлаждали. Срок хранения неограничен.

Приготовление раствора 2%-ного сульфаминовой кислоты. Растворяют 2 г сульфаминовой кислоты в 100 см³ бидистиллированной воды. Срок хранения 1 месяц.

Приготовление исходного раствора. В мерную пробирку объемом 10 см³ дозатором добавляют бидистиллированную воду в объеме 10 см³, вводят микрошприцем по 2 мм³ N-нитрозаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин). Весовое содержание компонентов в исходном растворе составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества): N-нитрозодиметиламин 0,2 мг/см³, N-нитрозодиэтиламин 0,2 мг/см³. Срок хранения раствора 30 дней.

Приготовление рабочего раствора. В мерную колбу объемом 50 см³, содержащую бидистиллированную воду в объеме 50 см³, вводят дозатором 2 мм³ исходного раствора N-нитрозаминов. Массовая концентрация N-нитрозодиметиламина в рабочем растворе составляет 0,008 мг/см³ и N-нитрозодиэтиламина 0,008 мг/см³. Срок хранения раствора 5 часов.

Приготовление градуировочных растворов. Градуировочные растворы N-нитрозаминов готовят в мерных колбах объемом 100 см³. Для этого в каждую колбу вносят по 50 см³ бидистиллированной воды и добавляют рабочий раствор для градуировки в соответствии с таблицей 2, содержимое колбы доводят до метки бидистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Следует подчеркнуть, что режимы и реагенты для этапа пробоподготовки были использованы те же, что и в прототипе, описанном в Методике МУК 4.4.1.011-93.

Для получения экстрактов необходимой чистоты для хромато-масс-спектрометрического анализа и установления достаточной степени концентрирования были апробированы сменные картриджи прибора ТФЭ, заполненные различными сорбентами, органические растворители для элюирования нитрозаминов с картриджей и изучены условия оптимальной схемы элюирования. Селективность проведения процесса ТФЭ достигнута подбором картриджа с соответствующей фазой.

Для этого апробированы следующие типы картриджей: угольный Coconut 6 мл; заполненные октадецилом Chromabond С18 на 100 и на 500 мг; картриджы на полимерной основе Strata на 200 мг.

Результаты исследования полноты извлечения нитрозаминов из стандартного образца с применением различных марок картриджей представлены в таблице 3.

Анализ полученных результатов, приведенных в таблице 3, показал, что на угольном картридже Coconut 6 мл полнота извлечения N-нитрозаминов из стандартного образца составила 97,5%.

Проведенные исследования показали недостаточную степень извлечения нитрозаминов из стандартных образцов. Поэтому были проведены дополнительные исследования по отработке оптимальных условий процесса элюирования нитрозаминов с угольного картриджа Coconut 6 мл с применением различных растворителей. Для этого варьировали:

- объемами растворителей на стадии кондиционирования - активации картриджа;

- объемами образца на стадии загрузки в картридж;

- временем сушки картриджа;

- объемом слива при элюировании образца с картриджа хлористым метиленом.

Экспериментально отработанные схемы элюирования нитрозаминов стандартного образца с угольного картриджа Coconut 6 мл методом твердофазной экстракции представлены в таблице 4.

Результаты исследования полноты извлечения нитрозаминов из стандартного образца методом введено-найдено с применением различных схем (см. таблицу 4) элюирования ТФЭ и угольного картриджа Coconut 6 мл приведены в таблице 5.

В процессе экспериментальных исследований были установлено, что наиболее оптимальной схемой элюирования нитрозаминов методом ТФЭ с использованием угольного картриджа Coconut 6 мл в предлагаемом способе является схема 7, которая включает несколько стадий:

1. Стадия кондиционирования - активация картриджа: картридж промывали хлористым метиленом объемом 2 см³, затем через картридж пропускали этилацетат объемом 2,5 см³ с задержкой растворителя в течение 30 сек. Для удаления остаточных количеств растворителей картридж промывали водой объемом 2 см³;

2. Стадия адсорбции целевых компонентов стандартного образца на картридже при загрузке пробы объемом 70 см³.

3. Сушка картриджа в течение 20 минут для удаления остаточных количеств образца.

4. Заключительная стадия ТФЭ - элюирование целевых аналитов с картриджа хлористым метиленом объемом 4 см³.

Таким образом, было установлено, что при реализации предлагаемого способа на стадии ТФЭ объемное соотношение хлористого метилена для промывки картриджа, этилацетата, воды, дистиллята пробы и хлористого метилена для элюирования должно составлять 1:1,25:1:35:2 соответственно.

При этих оптимально установленных условиях ТФЭ, далее при последующем хромато-масс-спектрометрическом анализе, при реализации предлагаемого способа была достигнута высокая эффективность разделения нитрозаминов стандартного образца, что наглядно иллюстрирует хроматограмма, приведенная на Фиг. 3. Эта хроматограмма показывает, что в стандартном растворе содержатся следующие N-нитрозамины: N-НДМА - N-нитрозодиметиламин = 0,02 мкг/см³, N-НДЭА - N-нитрозодиэтиламин = 0,02 мкг/см³.

Полнота извлечения нитрозаминов из стандартного образца для НДМА - 97,5%, для НДЭА - 100% была установлена при использовании угольного картриджа Coconut 6 мл и схемы элюирования 7 (таблица 5).

Для увеличения полноты экстракционного извлечения аналитов, особенно нитрозодиметиламина из стандартного образца, применяли дистилляцию перегретым паром (известно, что нитрозамины - летучие соединения и без разложения перегоняются с водяным паром).

Поэтому следующий этап исследований заключался в отработке условий дистилляции нитрозаминов стандартного образца с последующей сорбцией на угольный картридж Coconut 6 мл. Для этого исследуемый стандартный образец в объеме 25 см помещали в круглодонную колбу объемом 250 см³ для отгона, добавляли высаливающие реагенты (5 г сульфата натрия и 5 г хлорида натрия). Стандартный образец нитрозаминов подкисляли 2,5 мл 2%-ной сульфаминовой и 2,5 мл 1 н. серной кислотой до рН=3. С помощью перегретого водяного пара при t° парообразователя = 100±5°С и t° колбы со стандартным образцом = 80±5 С° отгоняли 25 см³ и 70 см³ дистиллята. Полученный дистиллят (объемом 25 см³ и 70 см³) пропускали через картридж Coconut 6 мл в системе твердофазной экстракции по схеме элюирования 7.

Затем полученные элюенты были проанализированы хромато-масс-спектрометрическим методом.

Результаты исследований полноты извлечения нитрозаминов из стандартных образцов методом введено-найдено с применением различных схем дистилляции и ТФЭ по схеме 7 представлены в таблице 6. Данные, приведенные в таблице 6, показывают, что комплексное использование дистилляции в сочетании с оптимальной схемой элюирования 7 и концентрированием дистиллята в объеме 70 см³ на угольный картридж Coconut 6 мл позволило достичь высокой полноты извлечения N-нитрозаминов из стандартного образца, которая составила для НДМА - 98,5%, для НДЭА - 100%.

Следует пояснить, что абсолютно такие же данные (таблицы 3-6), что и по стандартным образцам, были получены и для проб исследуемых каш, что подтверждает достоверность представленных данных.

Заключительным этапом исследований была апробация разработанного способа с использованием автоматической системы твердофазной экстракции Sepaths (ТФЭ) для хромато-масс-спектрометрического анализа N-нитрозаминов для различных видов детского питания.

Исследования стандартных образцов и проб каш различных производителей на содержание нитрозаминов выполняли методом хромато-масс-спектрометрии: газовый хроматограф Agilent 7890А (USA) с масс-селективным детектором 5975С и квадрупольным масс-анализатором. Режим ионизации электронным ударом при 70 эВ. Для исследований использовали капиллярную колонку серии HP-VOC 60 m ⋅ 0,2 mm ⋅ 1,12 μm длиной 60 метров, внутренним диаметром 0,2 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 1,8 μm.

Данные приведены в таблице 7, а также на хроматограммах нитрозаминов, обнаруженных в пробах каш. На фиг. 4 - для овсяной молочной каши «Винни» (N-НДМА = 0,0038 мг/кг, N-НДЭА = 0,0035 мг/кг); на фиг. 5 - для овсяной молочной с бананом Heinz (N-НДМА = 0,0043 мг/кг, N-НДЭА = 0,0012 мг/кг); на фиг. 6 - для мультизлаковой молочной «ФрутоНяня» (N-НДМА = 0 мг/кг, N-НДЭА = 0,00066 мг/кг).

Данные, приведенные в таблице 7, показывают, что предлагаемым способом было обнаружено повышенное содержание определяемых компонентов по сумме N-нитрозаминов в кашах относительно гигиенического норматива в диапазоне от 5,3 до 10,8 раз.

В молочных кашах мультизлаковой и гречневой с персиками и абрикосами «ФрутоНяня» содержание нитрозаминов установлено ниже ПДК.

Таким образом, предлагаемый способ имеет следующие преимущества перед известными:

- обеспечивает практически полное извлечение нитрозаминов из исследуемой пробы (для НДМА - 98,5%, для НДЭА - 100%), что свидетельствует о точности и достоверности предлагаемого способа;

- позволяет значительно снизить нижний предел определения нитрозаминов (до 0,4 мкг/кг продукта), в то время как в прототипе этот показатель составляет 1 мкг/кг продукта;

- обеспечить селективность и специфичность; более эффективное разделение нитрозаминов; высокое количественное извлечение исследуемого образца(>75%); отличную воспроизводимость, надежность и точность определения; легкость в реализации; возможность оптимизации процесса ТФЭ; экономию дорогих растворителей.