Результат интеллектуальной деятельности: ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ, ПОЛУЧЕННЫЙ ПРИ ФЕРМЕНТАЦИИ КОДЖИ

Область техники

Настоящее изобретение относится к ферментному препарату, получаемому при ферментации коджи, полученной из съедобных грибов (англ. mushrooms), ферментированных плесенью Aspergillus. Изобретение, кроме того, относится к ферментному препарату, получаемому при ферментации смеси грибов и зерновых, к способу получения ферментного препарата и к применению такого препарата.

Уровень техники

Гидролиз растительных белков представляет собой один из самых старых способов пищевой биотехнологии. На протяжении веков в странах Азии соевый белок гидролизовали для получения среди прочего соусов Shoyu, соевого соуса и традиционной приправы, которые в западных странах стали почти синонимом китайской кухни. В этих утомительных, иногда очень продолжительных процессах, необходимые протеолитические активности получают в ходе последовательных ферментаций под действием плесени Aspergillus, молочнокислых бактерий и дрожжей, растущих на соответствующих растительных субстратах.

В западных странах подражают этому способу, применяя белки пшеницы, риса или арахиса и заменяя ферментативный гидролиз кислотным гидролизом, например, применяя соляную кислоту, для эффективного раскрытия кинетически очень стабильных пептидных связей. Продукты, обычно обозначаемые как гидролизованный растительный белок (HVP), представляют собой или жидкие приправы, или их концентрируют с получением паст, порошков, готовых смесей для применения в композициях супа или соуса или в бульонных кубиках. Всем продуктам придают мясной запах и вкус, хотя ни на какой из стадий способа мясо не включают.

Поскольку после завершения гидролитического процесса кислота должна быть нейтрализована, добавляют гидроксид натрия. Хлорид натрия, образовавшийся в ходе данной реакции нейтрализации, способствует появлению свойств, усиливающих вкус растительного гидролизата, и часто приветствуется в конечном продукте.

Однако, у кислотного гидролиза есть много недостатков. Сильные кислоты и щелочи представляют собой опасные вещества, и их больше не рассматривают как совместимые с безопасной и пригодной для пищевых целей эксплуатацией, в особенности, при температурах выше 100°C. Еще большую проблему представляет неизбежное образование дихлор-соединений, таких как 1,2- и 1,3-дихлорпропанол, для которых было показано канцерогенное действие в исследованиях кормов для животных. Контакт липидной фракции сырья с соляной кислотой также приводит к образованию хлорированных стероидов, поскольку в реакциях Майяара образуются такие соединения, как 5-(хлорметил)фурфурол.

Для того чтобы избежать образования опасных или токсических соединений, внимание снова было обращено к ферментативным способам, в которых данные соединения и не нужны, и не образуются. Как следствие, наблюдается огромный интерес к усовершенствованию ферментативных способов. Ферменты, применяемых в таких способах, обычно представляют собой пептидазы и/или протеазы.

Обычные пептидазы представляют собой, например, алкалазы (сериновые пептидазы из Bacillus licheniformis), папаин (цистеиновые пептидазы из Carica papaya), химозин (сычужный фермент) из рекомбинантных штаммов Mucor и нейтразу (металл-пептидазу из Bacillus subtilis). В патенте US 3694316 описан способ получения протеазы из Basidiomycetes. Другие коммерческие пептидазы, такие как проназа или Flavorzyme®, представляют собой смеси активностей различных типов, продуцируемых такими бактериями, как Streptomyces griseus, или грибками аскомицетами, такими как Aspergillus oryzae.

Из-за своей биокаталитической природы ферментативный способ может быть проведен в мягких физических условиях и, таким образом, представляет собой более безвредный для окружающей среды способ по сравнению со своим катализируемым кислотой аналогом. Однако, в отличие от кислотного гидролиза, ферментативный способ часто не доходит до завершения и может давать в результате частично гидролизованные продукты с горьким привкусом. Степень горечи увеличивается с увеличением степени гидролиза, достигает максимума и затем падает при дальнейшем протекании гидролиза.

Были опубликованы многочисленные попытки ускорить ферментативный способ (Pedroche, J. et al., Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food chemistry, 2003) и избежать образования горьких пептидов (Maehashi K. et al., Molecular Methods of plant Analysis, 2002, 47-68).

Белки растений (Lamsal, B.P. et al., Journal of the American Oil Chemists' Society, 83 (8), 731-737, 2006) или животного происхождения (Je, J. et al., European Food Research and Technology, 221 (1-2), 157-162, 2005), или промышленные отходы, такие как рисовые отруби, служили в качестве субстратов (Jarunrattanasri, A. et al., ACS Symposium Series, 83-97, 2005). Такие субстраты, как гемоглобин, казеин и инсулин, также были исследованы (Suzuki, N. et al. Phytochemistry, 2005, 66, 983-990).

Соя и пшеница по-прежнему представляют собой наиболее распространенные субстраты для ферментативного гидролиза. Если биокатализатор не представляет собой интактную клетку, такую, например, как микроорганизм, то предлагают ферментные препараты, такие как нейтраза (WO 2006/103628), или комбинации растительных и микробных ферментов (WO 2002/078461; CN 1397644).

Пептидолиза пшеничного глютена, в частности, достигали, применяя алкалазу, панкреатин или пепсин (Kong, X. et al., Food Chemistry, 101, 615-620, 2007), или папаин (Wang, J. et al., Food Chemistry, 101, 1658-1663, 2007). Наконец, также известно, что гидролиз пшеничного глютена можно осуществлять ферментативно, применяя коммерчески доступные ферментные препараты, например, Flavorzyme®. Однако в разработке способов WGH-te (гидролизат пшеничного глютена - технические ферменты) по-прежнему остаются критические пункты, которые заключаются в высокой стоимости данных ферментов, в неудовлетворительной протеолитической активности доступных ферментных препаратов по сравнению, например, со способами кислотного гидролиза, в недостаточном переваривании нерастворимых остатков (например, фракции, обогащенные гликобелками) в гидролизате и в неудовлетворительной микробиологической защите гидролизатов, так как их следует применять без солей или при низких концентрациях солей и при температурах, которые делают возможным рост некоторых микроорганизмов, вызывающих порчу продуктов.

Таким образом, для гидролиза зерновых продуктов существует необходимость в ферментном препарате с усовершенствованными характеристиками.

Заявитель неожиданно обнаружил, что ферментный препарат, получаемый при ферментации коджи, полученной из грибов, применяемых в качестве сырья для способа ферментации, увеличивал экспрессию протеазы и/или пептидазы из плесени Aspergillus. Присутствие зернового продукта, например, пшеницы или ячменя, в способе ферментации дополнительно увеличивало протеолитическую активность данных ферментов. Кроме того, дополнительное увеличение продукции и/или активности могло быть получено путем добавления небольшого количества среды роста к способу ферментации.

Неочищенный ферментный препарат, полученный таким способом, был более активным, чем коммерческие ферментные препараты, например, Flavorzyme®, и приводил к увеличенной и обеспечивающей более высокую скорость протеолитической активности в отношении пшеничного глютена. Это позволяет применять данный ферментный препарат в более эффективном способе гидролиза зерновых продуктов, таких как пшеница или соя, что в результате приводит к усовершенствованному гидролизу данных сырьевых материалов. Способ гидролиза стал быстрее, что, таким образом, приводило к снижению риска порчи нежелательными микроорганизмами и снижало стоимость продукции путем применения неочищенного ферментного препарата вместо применения очищенного коммерческого фермента. Кроме того, и в отличие от способа, в котором применяли мощные коммерческие ферменты, например, алкалазы, не было выявлено посторонних привкусов, т.е. горечи.

Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в обеспечении ферментного препарата, который, по меньшей мере, частично преодолевает один или несколько из указанных выше недостатков известных ферментных препаратов.

Сущность изобретения

В первом аспекте изобретение обеспечивает ферментный препарат, получаемый при ферментации коджи, в котором ферментация коджи включает грибы, ферментированные плесенью Aspergillus.

Во втором аспекте изобретение обеспечивает способ получения ферментного препарата, включающий стадию ферментации грибов плесенью Aspergillus, предпочтительно ферментацию грибов совместно с зерновыми культурами.

Дополнительный аспект изобретения обеспечивает применение ферментного препарата изобретения для гидролиза зерновых продуктов или мясных продуктов, и для получения пищевых продуктов.

Краткое описание чертежей

Фигура 1: Стадии способа получения неочищенного ферментного препарата согласно изобретению.

Фигура 2: Фракционирование белка неочищенного ферментного препарата после элюирования через хроматографическую систему с Sepharose Fast Flow.

Фигура 3: Протеолитическая активность ферментов, полученных с помощью ферментации коджи грибами, по сравнению с препаратом Flavourzyme™. Величины приведены к 100% активности Flavourzyme™.

Раскрытие изобретения

Изобретение относится к ферментному препарату, получаемому при ферментации коджи, при этом ферментация коджи включает ферментацию грибов плесенью рода Aspergillus. Предпочтительно ферментация коджи дополнительно включает зерновые культуры, ферментированные Aspergillus.

Термин «ферментация коджи» относится к способу ферментации, например, к способу ферментации в твердом состоянии, соевых бобов, пшеницы, ячменя и/или риса плесенью, такой как Aspergillus, для получения различных традиционных блюд и напитков, например, мисо, соевого соуса, саке и т.п.

Ферментация коджи согласно изобретению включает грибы или смесь грибов предпочтительно, по меньшей мере, с одной зерновой культурой, которую выбирают из группы, состоящей из пшеницы, ячменя, риса или их комбинации. Авторы неожиданно обнаружили, что присутствие грибов в ферментационной смеси обеспечивает создание коджи со значительно возросшей протеолитической активностью в отношении глютена из зерновых культур. Смесь может включать от примерно 10 до 99 масс.% грибов, предпочтительно от примерно 60-90 масс.% грибов и/или от примерно 10 до 60 масс.% зерновой культуры, предпочтительно от примерно 10-40 масс.% зерновой культуры. В одном из воплощений смесь включает примерно 90 масс.% грибов и 10 масс.% зерновой культуры, при этом пшеница представляет собой предпочтительно зерновую культуру. Было обнаружено, что добавление зернового продукта выгодно влияет на консистенцию и проницаемость для воздуха, например, твердой фазы ферментации коджи. Это позволяет плесени Aspergillus лучше расти в коджи, улучшает гидратацию основы коджи и позволяет контролировать, например, температуру ферментации.

Зерновая культура может быть выбрана из группы, состоящей из цельных зерен злаков, глютена зерновых, отрубей зерновых, зерновой шелухи злаков, зерновых корешков злаков, обработанных зерен злаков или любой их комбинации.

Активность ферментного препарата может быть дополнительно увеличена добавлением небольших количеств среды роста при ферментации коджи. Преимущество заключается в том, что такая среда роста дополнительно увеличивает получаемый выход фермента и активность процесса ферментации, а также стабильность процесса ферментации коджи. Таким образом, ферментация коджи согласно изобретению дополнительно включает такую среду роста в диапазоне от примерно 0,1 до 10 масс.%, предпочтительно от примерно 1 до 6 масс.% и еще более предпочтительно от 1 до примерно 3 масс.% от общей массы смеси. Среду роста выбирают из группы, состоящей из обезжиренного соевого жмыха, дрожжевого экстракта, пептона, жидкого кукурузного экстракта или любой их комбинации.

Ферментация коджи согласно изобретению может включать гриб или смесь грибов, при этом грибы могут предпочтительно представлять собой съедобные грибы, которые выбирают из группы, состоящей из Coprinus comatus, Lentinula edodes, Agaricus bisporus, Agaricus campestris, Hypsizygus tessulatus, Pleurotus ostreatus, Pleurotus citrinipileatus, Pleurotus eryngii, Boletus edulis, Craterellus cornucopioides, Craterellus tubaeformis, Agaricus blazei, Volvariella volvacea, Agrocybe Aegerita и Ganoderma lucidum, или любой их комбинации. Грибы или смесь грибов может включать свежие грибы, сушеные или обработанные грибы, целые грибы или любые части грибов, такие как только ножки или только плодовые тела, и/или любую комбинацию из указанного выше. Преимущества применения сушеных или обработанных грибов по сравнению со свежими грибами заключаются в лучшем хранении и более легкой обработке данного растительного материала в промышленных условиях. Дополнительными преимуществами могут быть цена и доступность таких сырьевых материалов на протяжении всего года.

Коджи согласно изобретению предпочтительно ферментируют нитчатым грибком Aspergillus oryzae. Aspergillus oryzae обладает тем преимуществом, что он представляет собой хорошо изученный нитчатый грибок, применяемый при традиционных ферментациях коджи. Он абсолютно безопасен для употребления в пищу и обеспечивает типичные вкусоароматические ноты, присущие ферментированному соевому соусу.

Дополнительный аспект изобретения представляет собой способ получения ферментного препарата, описанный в настоящем изобретении, включающий стадию ферментации смеси грибов и, по меньшей мере, одной зерновой культуры Aspergillus. Таким образом, смесь грибов, по меньшей мере, с одной зерновой культурой может быть инокулирована с Aspergillus перед процессом ферментации. Альтернативно, грибы, инокулированые с Aspergillus, смешивают с зерновой культурой перед процессом ферментации. Неочищенный ферментный препарат, полученный данным способом, может быть применен непосредственно для такого применения, как описано ниже. Преимущество данного способа заключается в том, что может быть получен такой неочищенный ферментный препарат, который будет более активен по сравнению с любым из общеизвестных коммерческих ферментных препаратов, применяемых в настоящее время в промышеленных способах гидролиза пшеничного глютена. Дополнительное преимущество заключается в том, что не было выявлено посторонних привкусов, т.е. горечи, в продуктах гидролиза согласно изобретению.

Способ может дополнительно включать стадию, по меньшей мере, частичной очистки ферментного препарата с помощью, например, экстракции, разделения или концентрации или любой комбинации данных приемов. Ферментный препарат может, например, быть отделен и сконцентрирован с помощью хроматографии на DEAE-Sepharose. Стадии разделения и концентрирования ферментного препарата также могут включать технологию разделения на мембранах. Преимущество заключается в том, что активность ферментных препаратов может, например, быть дополнительно увеличена, что позволяет дополнительно увеличивать выходы гидролизата из выбранных сырьевых материалов. Кроме того, любое хранение, транспортировку, например, с одного места расположения завода к другому месту расположения завода и/или обработку на заводе можно сделать легче и дешевле.

Еще один дополнительный аспект изобретения представляет собой применение ферментного препарата изобретения для гидролиза зерновых продуктов, таких как, например, продукты из пшеницы или сои. Применение ферментного препарата позволяет усовершенствовать способ гидролиза глютена зерновых культур, включая, например, выход, скорость и стоимость способа ферментации, для снижения риска порчи под действием нежелательных микроорганизмов, и для улучшения вкуса, и для снижения любого постороннего вкуса гидролизованных продуктов.

Таким образом, более конкретно, применение ферментного препарата относится к получению пищевого продукта, такого как соус-приправа, вещество, придающее вкус, суп, сушеная приправа, бульон или паста. Может быть применен неочищенный ферментный препарат, полученный с помощью способа согласно изобретению.

Специалистам в этой области техники понятно, что они могут свободно комбинировать все существенные признаки настоящего изобретения, раскрытые в этом документе. В особенности существенные признаки, описанные для продукта согласно изобретению, могут быть скомбинированы со способом настоящего изобретения и наоборот. Кроме того, существенные признаки, описанные для различных воплощений настоящего изобретения, могут быть скомбинированы.

Дополнительно преимущества и существенные признаки изобретения будут понятны из фигур и примеров.

Примеры

Изобретение дополнительно описано с отсылкой к следующим примерам. Следует иметь в виду, что изобретение, как заявлено, не предназначено для ограничения каким-либо образом данными примерами.

Пример 1: Неочищенный ферментный препарат

Неочищенные ферментные препараты получали так, как показано на фигуре 1. Образцы субстратов коджи исходно получали путем перемешивания грибной основы (навозник белый (Coprinus comatus)), пшеничного глютена, цельных пшеничных зерен и пшеничных отрубей в соотношениях, представленных в таблице 1. Затем по 10 г каждого полученного субстрата коджи смешивали с 5 г воды, инокулировали спорами Aspergillus oryzae и после этого ферментировали в традиционной твердофазной системе ферментации коджи. Ферментацию проводили при 30°C в течение 30-ти часов при влажности воздуха, равной 80% относительной влажности воздуха. Затем, ферментированный коджи промывают в 80 мл воды при 4°C в течение 1-го часа. Коджи затем фильтруют и концентрат сохраняют в виде неочищенного ферментного препарата.

Пример 2: Ферментный анализ

Ферментативную активность различных неочищенных ферментных препаратов определяли следующим образом. 20 мл неочищенного ферментного препарата добавляли к 1 г пшеничного глютена в 30 мл 0,2 М фосфатного буфера (при pH 7,2) и полученную смесь инкубировали при 50°C в течение 30-ти мин. После этого смесь нагревали в течение 10-ти мин при 100°C для того, чтобы остановить дополнительно какие-либо ферментативные реакции. Затем определяли титрованием формольный азот (FN) в соответствии с протоколом, обеспеченным в ссылке Hawk, P.В., Oser, В.L., and Summerson, W.H. Henriques-Sørensen, Formol titration method: principle. In Practical Physiological Chemistry, Thirteenth edition. New York, Blakiston, 1954. pp.897-899. Формольное число позволяет оценить количество образовавшихся в растворе свободных аминокислот. В качестве холостой пробы для измерения ферментативной активности неочищенные ферментные препараты были исходно прогреты в течение 10 мин до 100°C с целью инактивировать ферменты, и после этого были обработаны таким же образом как образцы, примененные для измерения содержания формольного азота. Величины ферментативной активности рассчитывали следующим образом:

ΔFN=[(FN образца)-(FN холостой пробы)]/пшеничный глютен [мг/г] и на минуту инкубации.

Результаты представлены в таблице 2.

Формольный азот (FN), высвобождающийся в ходе ферментативного гидролиза, регистрировали в качестве индикатора протеолиза. Было обнаружено, что грибная основа представляет собой наиболее важный ингредиент в ферментированной основе коджи для оптимизации протеолиза раствора пшеничного глютена. Наилучший результат был получен с образцом 1 коджи-продукта. В соответствии с этим результатом было также обнаружено, что растворы пшеничного глютена после стадии гидролиза были наиболее просветленными, т.е. наиболее прозрачными образцами, если их гидролизовали с ферментной смесью из смеси коджи с самым высоким содержанием грибов. Можно заключить, что всякий раз, когда в ферментированном коджи присутствует грибная основа, последующий гидролиз раствора пшеничного глютена улучшается. Наилучших результатов достигают с высоким процентом такой грибной основы, как, например, в образце 1 с 90 масс.% грибов и 10 масс.% пшеничных отрубей в ферментированном коджи.

Пример 3

Субстрат коджи готовят с грибами в качестве основного компонента (примерно 90 масс.%), пшеничными отрубями (10 масс.%) (образец 1 в примере 1) и различными добавками, присутствующими в разных количествах. Ферментативную активность для гидролиза пшеничного глютена из различных экспериментов по ферментации определяли с помощью ортогональной модели эксперимента, и некоторые из результатов представлены в таблице 3. Величины представляют собой среднюю разницу величин, полученных от контрольного образца, т.е. ферментации без добавок (образец 1 из примера 2), и от образцов с добавлением 2 масс.% обезжиренных соевых бобов, дрожжевого экстракта или пептона.

Среди протестированных добавок пептон имел самое сильное положительное влияние на продуцирование формольного азота. Пептон стимулирует экспрессию экзопротеазы, с сильным положительным эффектом на выход свободных аминокислот протестированного раствора пшеничного глютена. Жмых обезжиреннных соевых бобов и дрожжевой экстракт также стимулируют экспрессию экзопротеазы, несмотря на тот факт, что общее воздействие на протеолитическую активность было не таким сильным, как наблюдавшееся для пептона. Таким образом, добавление определенных выбранных добавок при ферментации коджи может дополнительно улучшить протеолитический эффект ферментного препарата.

Пример 4

Неочищенный ферментный препарат по примеру 1 пропускали через хроматографическую систему с DEAE-Sepharose Fast Flow. На фигуре 2 показан результат. Каждый из пиков на графике показывает белки, которые присутствовали в ферментном препарате. Протеолитическую активность анализировали для каждого белкового пика, и было обнаружено, что только один пик, как показано на фигуре 2 стрелкой «2», обладает значительной протеазной активностью. Биохимическую очистку протеазы из ферментированного, выращенного на грибах коджи-препарата достигали осаждением сульфатом аммония и последующей хроматографией на DEAE-Sephadex A50 и Butyl-Sepharose CL-4B в соответствии со стандартными процедурами, известными специалисту в данной области.

Характеристики протеазы, выделенной из выращенного на грибах коджи-препарата, были следующими:

- Относительная молекулярная масса: 53,8 кДа (основанная на SDS-PAGE и ионной ловушке MS LCQ Deca XP).

- Изоэлектрическая точка: 4,1-4,2.

- Специфическая активность: 2274,7 Ед/мг.

В результате данной частичной очистки препарата получают ферментный препарат с увеличенной в 67,1 раза ферментативной активностью. Выход фермента после очистки составляет 11,3%. Протеолитическую активность последовательно частично очищенного ферментного препарата, полученного с помощью выращенного на грибах коджи, сравнивали с протеолитической активностью коммерчески доступного очищенного Flavourzyme™, в реакции гидролиза или пшеничного глютена, или казеина. Результат показан на фигуре 3, в этом случае протеолитическую активность о Flavourzyme™ принимали за 100% и сравнивали с частично очищенным ферментным препаратом изобретения. Следовательно, протеолитическая активность частично очищенного ферментного препарата, полученного с помощью выращенного на грибах коджи, превосходит протеолитическую активность широко применяемого коммерческого препарата Flavourzyme™.

Пример 5

Коджи-субстрат (содержащий сушеные грибы и пшеничный глютен) перемешивают с водой, инокулируют спорами Aspergillus oryzae и инкубируют при 30°C и 80% относительной влажности воздуха в течение 30-ти часов. Коджи собирают, перемешивают с водой и пшеничным глютеном и выдерживают при 50°C в течение 3-х часов. Раствор фильтруют и реакцию останавливают нагреванием супернатанта до температуры выше 90°C в течение 10-ти мин. Полученный соус оценивали с помощью нестандартизированого испытания. Типичные вкусоароматические ноты гидролизованного пшеничного глютенового соуса были достигнуты, и никакие горькие посторонние привкусы не чувствовались.

Следует иметь в виду, что хотя изобретение было описано с отсылкой к специфическим воплощениям, изменения и модификации могут быть выполнены без отступления от объема изобретения, определенного в формуле изобретения. Кроме того, если для существенных признаков существуют известные эквиваленты, такие эквиваленты включают, как если бы они специально были упомянуты в данном описании.