09.05.2019
219.017.4c92

Композиции против воспалительных процессов

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
№ охранного документа
0002312672
Дата охранного документа
20.12.2007
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к медицине и ветеринарии. Пищевая и кормовая композиции для снижения риска воспаления содержит крахмальную матрицу и экстракт цикория, содержащий терапевтически эффективное количество α-метилен-γ-бутиролактона, способного ингибировать ферментную активность, связанную с циклооксигеназой, и транскрипционную активность СОХ-2 в организме млекопитающего. Пищевая и кормовая композиции для предупреждения или лечения воспаления содержит экстракт цикория, содержащий терапевтически эффективное количество α-метилен-γ-бутиролактона. Применение экстракта цикория, содержащего терапевтически эффективное количество α-метилен-γ-бутиролактона, для приготовления пищевой или кормовой композиции для ингибирования активности СОХ-2. Изобретение способствует предупреждению или лечению воспаления у млекопитающих. 5 н.п. ф-лы, 3 табл.
Реферат Свернуть Развернуть

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в общем смысле относится к композициям. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, которые включают термически обработанный (например, экструдированный) растительный материал, такой как цикорий и/или его экстракты, для улучшения здоровья человека и животных. Растительный материал получают из растений семейства Asteracae, содержащих требуемое и эффективное количество сесквитерпеновых лактонов, которые при нагревании высвобождают свой активный фрагмент - α-метилен-γ-бутиролактон (α-MGBL), или из других растений, которые содержат тот же или в основном тот же класс соединений, таких как кофе или соя.

Предшествующий уровень техники

Необходимость улучшения здоровья млекопитающих потребовала и продолжает требовать непрерывного проведения научных исследований и открытий по профилактике и/или лечению заболеваний. Например, раздражение или недомогание могут быть вызваны воспалительным процессом в организме млекопитающего, например воспалением кожи, воспалением глаз, воспалением кишечника и т.п. Кроме того, существует мнение, что хроническое воспаление может увеличить риск развития другого заболевания или недомогания, такого как остеоартрит, аутоиммунная болезнь, рак или т.п. При этом предполагается, что причиной воспалительного процесса является усиленная транскрипционная активность фактора транскрипции NF-kB, которая приводит к экспрессии провоспалительных и воспалительных ферментов и рецепторов. Если говорить более конкретно, то воспаление может возникать как следствие повышенной активности ферментов в организме млекопитающего, например повышенной активности циклооксигеназы (СОХ), включая циклооксигеназу-1 (СОХ-1), циклооксигеназу-2 (СОХ-2) или др.

Общеизвестно, что пищевые, диетические или другие питательные источники содержат ряд компонентов или агентов, способных, как предполагается, защитить человека и животных от болезней. Сообщается, например, что олигосахариды, такие как инулин и различные фруктоолигосахариды, обладают пребиотическим действием, способствуя росту бифидобактерий и молочнокислых бактерий в желудочно-кишечном тракте за счет патогенов, включая, например, Clostridium perfringens (см., например, Gibson et al., Food Microbiology, 11(6), pp.491-498 (1994)). Хотя большинство экспериментов, о которых сообщается, проводилось in vitro, тем не менее, имеются сообщения и о том, что указанные олигосахариды проявляют аналогичное действие в кишечнике крыс и человека. Общеизвестно, что стимулирование роста бифидобактерий и молочнокислых бактерий при использовании олигосахаридов может обеспечить ряд разного рода положительных воздействий на животных и человека, таких как предупреждение и/или лечение диареи, ускорение роста, улучшение способности к размножению или другие благоприятные воздействия, которые улучшают здоровье.

Инулин или другие питательные агенты, которые, как предполагается, способствуют улучшению здоровья человека и животных, что обсуждалось выше, в большинстве случаев получают из растений или других натуральных источников. Например, общеизвестно, что инулин очищается из растений, которые содержат высокие концентрации инулина, таких как цикорий, топинамбур, лук-порей и спаржа. Для этого растение перед его использованием обычно очищают или обрабатывают каким-либо другим способом с тем, чтобы улучшить его вкус и аромат, например путем устранения или, по меньшей мере, сведения к минимуму привкуса горечи, обычно ассоциируемого с цикорием. См., например, патент США 4865852.

В большинстве случаев очищенный растительный продукт получают путем гидролиза кислотами или ферментами. Гидролизат собирают и сгущают для получения биоактивного агента, такого как инулин. Например, в JP 63-309147 раскрывается способ измельчения корней цикория, частичного гидролиза их кислотами и сушки полученного гидролизата с проведением или без проведения нейтрализации. Однако очистка, например, фруктоолигосахаридов или инулина может значительно увеличить стоимость диетического продукта. В результате потребление таких диетических продуктов, как правило, ограничивалось продуктами специального назначения или диетическими продуктами для человека и животных.

Следовательно, существует потребность в композиции, включающей натуральные ингредиенты, такие как термически обработанный цикорий и/или его экстракты, которые обладают приемлемым для человека и животных вкусом, которые можно получать относительно недорогим способом и которые могут улучшить здоровье человека и животных, например предупредить и/или вылечить воспаление.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, которые можно использовать для улучшения здоровья человека и животных, в частности, для предупреждения и/или лечения воспалений. Композиции согласно настоящему изобретению включают один или более фитохимических агентов, получаемых из термически обработанного (например, экструдированного) растительного источника, такого как цикорий.

Авторы заявки показали, что экстракты корня цикория содержат один или более фитохимических веществ, обладающих способностью ингибировать ферменты и/или транскрипционную активность в организме млекопитающих, например ферментную активность, связанную с циклооксигеназой, и транскрипционную активность, связанную с NF-kB. Авторы заявки показали далее, что термически обработанные (например, экструдированные) экстракты корня цикория обладают повышенной активностью к ингибированию ферментов, относящихся к циклооксигеназам, и/или повышенной ингибирующей способностью по отношению к NF-kB. Авторы заявки установили зависимость между повышенной способностью к ингибированию образования активных молекулярных видов, а именно α-метилен-γ-бутиролактона (α-MGBL), в процессе термической обработки.

Доказано, что ингибирование такой ферментной/транскрипционной активности предупреждает и/или способствует лечению воспаления у млекопитающих. Путем ингибирования воспалительного процесса может снизиться риск возникновения другой болезни или недомоганий, например рака, которые, как предполагается, являются результатом воспаления (например, хронического воспаления).

С этой целью в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения обеспечивается питательная композиция. Композиция содержит терапевтически эффективное количество растительного материала, который включает один или более термически обработанных (например, экструдированных) фитохимических агентов, способных ингибировать ферментную активность и тем самым предупреждать и/или излечивать воспаление у млекопитающего. Количество растительного материала предпочтительно составляет, по меньшей мере, 0,5 мас.%.

В одном из вариантов растительный материал получают из растений семейства Asteracae или некоторых других растений, таких как кофе, соя и т.п., или их комбинаций. Предпочтительно растительный материал получают из цикория, салата-латука, кофе, сои и т.п. или их комбинаций. В одном из вариантов растительный материал включает экстракт цикория.

Композиции могут включать и другие пищевые агенты, получаемые из растительного источника в дополнение к фитохимическим агентам. Указанные пищевые агенты могут включать любой пригодный компонент, способный ингибировать ферментативную активность, связанную с циклооксигеназой. В одном из вариантов пищевые агенты в дополнение к фитохимическим агентам включают антиоксиданты, глюкозамин, хондроитинсульфат, омега-3 жирные кислоты, другие соответствующие пищевые агенты и их комбинации.

Настоящее изобретение обеспечивает также корм для домашних животных. Корм для домашних животных включает крахмальную матрицу и эффективное количество термически обработанного (например, экструдированного) растительного материала, содержащего фитохимический агент, способный ингибировать ферментную активность в организме млекопитающего, что снижает риск воспаления.

В другом варианте настоящего изобретения обеспечивается способ производства питательного пищевого продукта, способного снижать риск возникновения воспаления в организме млекопитающего. Способ включает стадии обеспечения растительного материала; термической обработки растительного материала с получением растительного экстракта, содержащего один или более фитохимических агентов, способных ингибировать ферментную активность в организме млекопитающего, и обработки растительного экстракта и одного или более пищевых ингредиентов с получением питательного пищевого продукта, который содержит по меньшей мере 1 мас.% растительного экстракта.

Предпочтительно растительный экстракт обрабатывается путем обезжиривания растительного материала с получением первого растительного экстракта и последующей обработки первого растительного экстракта кислотным гидролизом с применением этилацетата для получения растительного экстракта.

Настоящее изобретение обеспечивает также применение терапевтически эффективного количества термически обработанного, например экструдированного, растительного материала, включающего один или более фитохимических агентов, способных ингибировать ферментную активность в организме млекопитающего, для приготовления композиции, предназначенной для снижения риска воспаления у млекопитающего. С понижением ферментной активности риск воспаления в организме млекопитающего может снизиться, благодаря чему может уменьшиться риск возникновения других заболеваний или недомоганий, вызываемых воспалением, таких как остеоартрит, аутоиммунная болезнь, рак или т.п.

Преимуществом настоящего изобретения является обеспечение улучшенной композиции, которая может применяться для снижения риска возникновения воспаления в организме млекопитающего. В таком контексте композиция способна ингибировать ферментную активность, результатом чего, как предполагается, является излечивание и/или предупреждение воспаления.

Другим преимуществом настоящего изобретения является обеспечение улучшенной композиции, которая включает растительный материал, содержащий один или более фитохимических агентов, способных ингибировать ферментную активность, например, связанную с циклооксигеназой, что, как предполагается, способствует предупреждению и/или излечиванию воспаления у млекопитающих.

Еще одним преимуществом настоящего изобретения является обеспечение способов производства улучшенных композиций, содержащих растительный материал, который может усилить вкусовые качества композиции при сохранении способности растительного материала к ингибированию ферментной активности, что способно снизить риск воспаления в организме млекопитающего.

И, наконец, еще одним преимуществом настоящего изобретения является обеспечение способов лечения и/или профилактики воспаления у млекопитающих, которые предусматривают прием улучшенной композиции.

Дополнительные отличительные особенности и преимущества настоящего изобретения описаны и станут более очевидньми из приведенного ниже подробного описания изобретения.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 показывает ингибирование экспрессии СОХ-2 в НТ29 клетках под действием α-метилен-γ-бутиролактона (α-MGBL) согласно одному из вариантов настоящего изобретения.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, которые содержат, по меньшей мере, один или более фитохимических агентов, получаемых из термически обработанных, например экструдированных, натуральных источников, таких, каким является растительный материал, который может использоваться для эффективного предупреждения и/или лечения воспаления у человека и животных.

Авторы заявки сделали открытие, что при термической обработке некоторых растений и/или растительных экстрактов, например цикория, может происходить образование фитохимических и аналогичных веществ, которые обладают повышенной способностью к ингибированию активности ферментов циклооксигеназ и/или повышенной транскрипционной активности NF-kB в организме млекопитающих, что, как предполагается, снижает риск воспаления, включая, например, воспаление кожи, воспаление глаз, воспаление кишечника, воспаление толстой кишки и т.п. В одном из вариантов ферментная активность связана с циклооксигеназой, например циклооксигеназой-1 и/или циклооксигеназой-2.

Авторы заявки на примере ряда тестов показали, что термически обработанные, например экструдированные, растительные экстракты, в частности экстракты цикория, могут ингибировать активность циклооксигеназ, а также транскрипционную активность NF-kB. В частности, высказано предположение, что термически обработанные (например, экструдированные) экстракты цикория оказывают более выраженное действие на ингибирование циклооксигеназы-2 по сравнению с циклооксигеназой-1. Именно благодаря ингибированию этого вида ферментной активности возможно, как предполагается, снижение риска воспаления у млекопитающих. Предполагается также, что за счет снижения риска воспаления может снизиться риск возникновения других заболеваний или недомоганий, причиной которых, как предполагается, служит воспаление, в частности хроническое воспаление. Другие заболевания могут включать, например, рак, аутоиммунную болезнь, остеоартрит и их комбинации.

Известно, что в дополнение к фитохимическим веществам, что обсуждалось выше, растения, такие как цикорий, содержат также пребиотические волокна, например олигосахариды, включая инулин, которые, как предполагается, снижают опасность заболевания раком в частности раком толстой кишки. В этой связи авторы заявки считают, что полезные преимущества в плане предупреждения и/или лечения рака у человека и животных могут быть реализованы благодаря комбинированному действию пребиотических волокон и фитохимических веществ, способных ингибировать ферментную активность, что способствует предупреждению и/или лечению воспаления у млекопитающих, в частности хронического воспаления, которое может вызвать рак, например рак толстой кишки, если не лечить указанное воспаление.

Авторы заявки показали также, что на способность термически обработанной (например, экструдированной) композиции настоящего изобретения к ингибированию ферментов не оказывают существенного влияния условия обработки в ходе производства композиций согласно настоящему изобретению. Например, очистка растительного материала способом согласно настоящему изобретению, которая может проводиться с целью уменьшения привкуса горечи в растительном экстракте и улучшения тем самым его вкуса для человека и животных, оказывает ничтожно малое влияние, если вообще оказывает, на питательные свойства готового очищенного продукта. Поэтому готовый экстракт можно получать, по существу, из грубых растительных экстрактов, например цикория. Это позволит исключить необходимость дорогостоящей очистки или других способов обработки растительного материала, необходимых для получения конечных биоактивных фракций.

В контексте настоящего описания термин "биоактивный агент" или другие аналогичные термины, например "биоактивные фракции", обозначает любой компонент или компоненты, которые могут проявлять биологическую активность, химическую активность или аналогичную активность в организме млекопитающего(щих), способную улучшить здоровье млекопитающего. Примеры биоактивных агентов включают, например, пребиотические волокна, фитохимические вещества или т.п.

В контексте настоящего описания термин "пребиотик" или другие аналогичные термины, включая "пребиотическое волокно", обозначает вещество или компонент, который может стимулировать рост микроорганизмов в организме млекопитающих.

В контексте настоящего описания термин "фитохимическое вещество" или другие аналогичные термины, включая "фитохимические вещества" и "фитохимический агент", обозначает любое химическое вещество, продуцируемое растением, которое, как предполагается, способно оказывать полезное влияние на здоровье человека и/или животных, например способно предупреждать и/или излечивать воспаление или другие аналогичные заболевания.

В контексте настоящего описания термин "ферментная активность" или другие аналогичные термины, такие как "ферментативная активность", обозначает любой, пригодный для данной цели фермент, который способен действовать как катализатор соответствующего биологического, химического или любого другого процесса, который, как предполагается, оказывает влияние на здоровье млекопитающих. Например, ингибирование ферментной активности, связанной с циклооксигеназой, может снизить, как предполагается, риск возникновения воспаления.

В контексте настоящего описания термин "термическая обработка" или другие аналогичные термины, например "экструзия", "экструдирование" и "экструдированный", обозначает нагревание растительного материала и/или растительного экстракта до температуры, выше стандартной температуры (например, 25° по Цельсию или 278 по шкале Кельвина), в специальной установке, например в печи или экструдере либо в другой аналогичной установке, способной повысить температуру обрабатываемого материала.

Композиция может включать любые, пригодные для данной цели и сочетающиеся друг с другом виды и количество компонентов, которые позволяют эффективно применять эту композицию для предупреждения и/или лечения воспаления. В одном из вариантов композиция включает растительный материал, который содержит один или более видов пребиотических волокон и фитохимических агентов, способных ингибировать ферментную активность, например активность ферментов циклооксигеназ, что, как предполагается, обусловливает предупреждение и/или лечение воспаления. К композиции можно с достаточной эффективностью добавлять целый ряд растительных материалов, включая, например, цикорий, салат-латук, кофе, сою, топинамбур, лук-порей, спаржу, их экстракты и их комбинации. В одном из вариантов предпочтительными являются цикорий и/или экстракт цикория.

Следует заметить, что растительный материал можно подвергать обработке для получения экстракта с применением целого ряда различных и пригодных для данной цели способов. В большинстве случаев растительный материал, например корень цикория, измельчают, превращают в порошок или в другую удобную форму. Затем растительный материал можно подвергнуть последующей обработке в несколько стадий для получения экстракта. В одном из вариантов изобретения предусматривается обезжиривание растительного материала с получением экстракта из жиров, удаленных из растительного материала. Процесс обезжиривания можно проводить в любых, пригодных для обезжиривания условиях с применением пригодных для данной цели видов и количества растворителей, включая, например, гексан.

В одном из вариантов экстракт от стадии обезжиривания можно подвергнуть последующей обработке кислотным гидролизом с получением другого вида растительного экстракта, который можно вводить в композицию согласно настоящему изобретению. Процесс кислотного гидролиза можно проводить в любых, пригодных для этого условиях с применением любых, пригодных для данной цели видов и количества растворителей, включая, например, этилацетат.

В одном из вариантов экстракт от стадии обезжиривания можно обработать методом экстракции растворителем. Экстракцию растворителем можно проводить в любых, пригодных для этого условиях и в присутствии любого, пригодного для данной цели количества и вида растворителя. В одном из вариантов растворитель включает раствор метилового спирта ("МеОН") и воду, смешанных в объемном соотношении 1:1. Полученный в результате смешивания раствор для проведения экстракции растворителем можно затем обработать выпариванием растворителя в пригодных для этого условиях с целью получения другого экстракта. Альтернативно: полученный в результате смешивания раствор можно обработать адсорбентом, например поливинилполипирролидоном или аналогичным агентом, с целью улавливания полифенолов. Обработку адсорбентом можно проводить в любых, пригодных для этого условиях. Конкретные примеры приготовления растительных экстрактов согласно одному из вариантов настоящего изобретения подробно описаны ниже.

В одном из вариантов измельченный растительный материал подвергается термической обработке. Авторы заявки показали, что именно при таком способе обработки сырой растительный материал, который содержит нативные сесквитерпеновые лактоны (SQL), обогащается высокоактивными СОХ-2-ингибирующими молекулярными видами, а именно α-метилен-γ-бутиролактоном (α-MGBL). Указанные молекулярные виды фактически обладают повышенной теплоустойчивостью по сравнению с другими SQL. Например, было показано, что эти молекулярные виды ингибируют воспалительную активность частично за счет прямого взаимодействия с транскрипционным фактором NF-kB и ингибирования его связывания с ДНК. Предполагается, что ингибирование является результатом алкилирования аминокислоты Cys38 в домене р65 NF-kB. Ингибирование проявляется в снижении экспрессии некоторых провоспалительных и воспалительных рецепторов и ферментов, среди которых циклооксигеназа-2. SQL вообще и α-MGBL, в частности, ингибируют активность СОХ-2 и/или ее экспрессию. Авторы заявки показали, что α-СН2-γ-бутиролактон обладает специфичной ингибирующей способностью, преимущественно по отношению к высокой потенциальной активности СОХ-2.

В одном из вариантов пребиотическое волокно (волокна) и фитохимический агент (агенты) композиции могут быть получены из традиционного или одного и того же растительного материала, такого как цикорий. Как обсуждалось выше, авторы заявки считают, что комбинированное действие пребиотического волокна и фитохимического источника растений, таких как цикорий, может проявляться в виде усиленного хемозащитного эффекта, который может способствовать лечению и/или предупреждению воспаления у млекопитающих. Пребиотическое волокно может использоваться в любом, пригодном для данной цели количестве и может быть любого, пригодного для данной цели вида, включая, например, олигосахариды, такие как инулин и различные фруктоолигосахариды, олигосахариды сои и их комбинации.

Фитохимические агенты могут быть любого, пригодного для данной цели вида и использоваться в любом, пригодном для данной цели количестве, способном ингибировать активность фермента СОХ-2 или транскрипционную активность NF-kB, что, как предполагается, способствует предупреждению и/или лечению воспаления. В одном из вариантов фитохимический агент растительного материала способен ингибировать циклооксигеназную активность, например активность циклооксигеназы-1 и/или циклооксигеназы-2, и/или транскрипционную активность NF-kB. Путем ингибирования ферментной и/или транскрипционной активности фитохимические агенты настоящего изобретения способны, как предполагается, предупреждать и/или излечивать воспаление, включая, например, хроническое воспаление. Благодаря этому может снижаться риск возникновения другой болезни или недомоганий, которые, как предполагается, вызываются воспалением, таких как рак, остеоартрит, аутоиммунная болезнь.

В дополнение к фитохимическим агентам растительный источник может содержать другие пищевые агенты, которые способны ингибировать ферментную активность. В одном из вариантов пищевые агенты включают антиоксиданты, глюкозамин, хондроитинсульфат, омега-3 жирные кислоты и др. и их комбинации.

Следует отметить, что композиция настоящего изобретения может иметь самую разную, требующуюся для каждой конкретной цели форму. В одном из вариантов композиция может быть в виде питательной добавки, пищевого препарата для человека и/или животных, корма для домашних животных и/или фармацевтической и/или функциональной пищевой композиции и т.п. Композиция может вводиться в пищевой продукт в любом, требуемом количестве. В одном из вариантов пищевой продукт включает растительный материал композиции в количестве по меньшей мере 0,5 мас.%, предпочтительно примерно, от 1 до 30 мас.%, более предпочтительно примерно от 1 до 2 мас.%.

В другом варианте фармацевтические композиции, содержащие активный ингредиент(ы) (например, α-метилен-γ-бутиролактон; содержащие его фрагменты или экстракты), могут иметь любую форму, удобную для их орального приема, например форму таблеток, пастилок, ромбовидных лепешек, водных или масляных суспензий, дисперсных порошков или гранул, эмульсий, твердых или мягких капсул, сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для орального потребления, могут быть приготовлены любым способом, известным специалистам в области производства фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать один или более агентов, выбираемых из группы, состоящей из подсластителей, ароматизаторов, красителей и консервантов, с тем, чтобы обеспечить фармацевтически приемлемые препараты с хорошим вкусом. Таблетки содержат активный ингредиент(ы) в смеси с нетоксичными, одобренными к применению в фармацевтике средами-основами, такими как инертные разбавители, агенты, облегчающие гранулирование, диспергаторы и смазочные агенты, которые пригодны для применения в производстве таблеток. Таблетки могут быть без покрытия или могут иметь покрытие, нанесенное известным способом, которое задерживает расщепление и всасывание в желудочно-кишечном тракте и обеспечивает тем самым пролонгированное действие в течение более длительного периода времени. Составы для орального потребления могут иметь форму твердых желатиновых капсул, в которых активные ингредиенты смешаны с водой или масляной средой. Водные суспензии содержат активный материал в смеси со средами-основами, пригодными для использования в производстве водных суспензий, такими как, например, суспендирующие средства, диспергаторы или смачивающие средства, консерванты, красители, ароматизаторы и подсластители. Дисперсные порошки и гранулы, пригодные для приготовления водной суспензии при добавлении воды, обеспечивают активный ингредиент(ы) в комбинации с диспергатором или смачивающим средством, суспендирующим средством и одним или более консервантов. Могут также присутствовать дополнительные агенты, например подсластители, ароматизаторы и красители.

В одном из вариантов настоящее изобретение обеспечивает корм для домашних животных, который включает крахмальную матрицу и эффективное количество растительного материала, при этом растительный материал содержит пребиотическое волокно и фитохимический агент, способный ингибировать ферменты или ферментную активность, что, как предполагается, способствует улучшению здоровья млекопитающих, в частности предупреждению и/или лечению воспаления. Корм для домашних животных согласно настоящему изобретению может содержать любое, пригодное для данной цели число, вид и количество компонентов и может обрабатываться любым, пригодным для данной цели способом для получения требуемой формы продукта.

В одном из вариантов настоящее изобретение включает желированный зерновой продукт, который содержит определенное количество растительного материала. Растительный материал содержит, по меньшей мере, источник пребиотических волокон и фитохимические агенты, способные ингибировать ферментную активность в организме млекопитающих, что, как предполагается, способствует улучшению здоровья млекопитающих.

В одном из вариантов растение содержит инулин в количестве, достаточном для обеспечения, по меньшей мере, примерно 0,25 мас.% инулина в пересчете на сухое вещество. В качестве растительного материала может использоваться любой, пригодный для данной цели источник с высоким уровнем содержания инулина, такой как, например, цикорий, салат-латук, кофе, соя, топинамбур, лук-порей, лук репчатый, якон (редька японская), спаржа или смеси этих растений. В одном из вариантов предпочтительными являются цикорий и топинамбур. В одном из вариантов растительный материал содержит, по меньшей мере, 50 мас.% инулина. В целях облегчения транспортировки растительный материал используется предпочтительно в сухом и измельченном виде или в виде порошка. Как показано ниже, в способах используется сухой, измельченный цикорий и/или его экстракты. Однако, само собой разумеется, что любой, пригодный для данной цели растительный материал может использоваться в любом, пригодном для данной цели виде и добавляться в зерновой продукт в любом, пригодном для данной цели количестве.

Как указано ниже, остальные ингредиенты, входящие в состав желированного зернового продукта, могут представлять собой любые, пригодные для данной цели ингредиенты, традиционно использующиеся в производстве желированных зерновых продуктов. Обычно эти ингредиенты включают источник крахмала и источник белка. Пригодными для данной цели источниками крахмала являются, например, зерновые культуры, такие как кукуруза, рис, пшеница, овес, ячмень, а также свекла, соя или смеси перечисленных культур. Пригодные для данной цели источники белка могут выбираться из любых, пригодных для данной цели источников животного или растительного белков. Примеры включают мясную муку, костную муку, рыбную муку, концентраты соевого белка, белки молока, глютен и т.п. Выбор источников крахмала и белка в значительной мере определяется потребностями животного или человека в питательных веществах, вкусовыми факторами, видом приготовляемого зернового продукта и другими аналогичными факторами. При необходимости в желированный зерновой продукт можно вводить другие ингредиенты, например сахар, соль, специи, приправы, витамины, минеральные вещества, ароматизаторы, жиры и т.п.

Производство желированного зернового продукта может осуществляться самыми различными способами в зависимости от требований. Однако в случае сухого зернового продукта особенно пригодным способом его производства является экструзионная варка. Она может осуществляться по хорошо известной специалистам в данной области технологии. Например, согласно одному, пригодному для данной цели способу кормовая смесь подается в установку для предварительного кондиционирования. Кормовая смесь готовится, главным образом, из источника крахмала, источника белка и растительного материала, такого как цикорий. В одном из вариантов цикорий составляет по меньшей мере примерно 1 мас.% кормовой смеси, предпочтительно по меньшей мере примерно 2 мас.%. В одном из вариантов количество растительного материала в кормовой смеси колеблется примерно от 10 до 20 мас.%, предпочтительно составляет примерно 10 мас.%.

В установке для предварительного кондиционирования в кормовую смесь вмешивается вода или пар, либо вода и пар вместе. При этом в кормовую смесь вмешивается такое количество воды или пара, которое достаточно для увлажнения смеси. При необходимости температура кормовой смеси в установке для предварительного кондиционирования может повышаться примерно до температуры от 60 до 90°С. Подходящая для данной цели установка для предварительного кондиционирования описана в патенте США 4752139. Следует заметить, что установка для предварительного кондиционирования может и не потребоваться.

Из установки для предварительного кондиционирования увлажненный корм поступает в экструдер. Экструдер может быть любого, пригодного для данной цели типа: одношнековый или со сдвоенным шнеком, либо аппарат экструзионной варки. Такие экструдеры выпускаются фирмами Wenger Manufacturing Inc.; Clextral S.A.; Bühler A.G. и др. При пропускании через экструдер увлажненный корм проходит через зону варки, в которой он подвергается воздействию механического усилия сдвига и нагревается (в одном из вариантов увлажненный корм нагревается до максимальной температуры примерно 150°С), и зону формования. Давление в зоне формования составляет примерно от 300 кПа до 10 МПа в зависимости от требований. При необходимости в зону варки может вводиться вода или пар или вода и пар вместе. При прохождении через экструдер источник крахмала в увлажненном корме клейстеризуется с образованием желированной матричной структуры в основном из крахмала, белка и растительного материала, такого как цикорий.

Клейстеризованная матрица на выходе из экструдера продавливается через экструзионную головку соответствующего размера, описанную, например, в ЕР 0665051. Из экструзионной головки выходит формованный экструдат, форма поперечного сечения которого соответствует форме отверстия головки. В зависимости от условий в экструдере и используемого источника крахмала формованный экструдат увеличивается в объеме в большей или меньшей степени. Затем формованный экструдат с помощью специальных лезвий нарезается в виде кусочков. Отдельные кусочки при необходимости высушиваются, покрываются защитными или ароматизирующими агентами, или сразу двумя указанными видами агентов. После охлаждения кусочки можно упаковать в соответствующие упаковки. Альтернативно отдельные кусочки можно переработать в хлопья с последующей их сушкой.

В зависимости от используемых ингредиентов желированный зерновой продукт может иметь форму высушенных крупных кусков, пригодных для использования в качестве корма для домашних животных; воздушных (взорванных) кусочков, пригодных для употребления в качестве зерновых завтраков; хлопьев, пригодных для употребления в качестве зерновых завтраков и т.п.

Производство сухого зернового продукта можно осуществлять также путем смешивания воды с ингредиентами зернового продукта, например, в установке для предварительного кондиционирования. Влажной смеси можно придать затем требуемую форму, используя для этой цели, например, формующие вальцы. Формованную смесь можно затем выпекать в печи при требуемой температуре. В одном из вариантов температура колеблется примерно от 220°С до 280°С в течение времени, необходимого для выпекания. В одном из вариантов время выпекания колеблется примерно от 10 минут до 1 часа. Сухой зерновой продукт по внешнему виду похож на готовое печенье.

Если требуется приготовить продукт, имитирующий мясной продукт, который может использоваться в консервированных кормах для домашних животных, то для этого можно использовать любой, пригодный для указанной цели способ. Например, способы, описанные в патентах США 4781939 и 5132137. Согласно этим способам источник белка, преимущественно мясной материал, подвергается эмульгированию. В качестве мясного материала можно использовать любой, пригодный для данной цели источник животного белка, включая, например, мышечные или скелетные ткани млекопитающих, птицы, отходы от переработки рыбы или мяса, такие как сердце, печень, почки, язык и т.п., либо мясную муку. При необходимости можно ввести также источники растительного белка. Конкретный состав продукта может выбираться в зависимости от стоимости и требуемых показателей вкуса и аромата. Эмульгирование можно проводить в любом, пригодном для этого оборудовании.

К эмульсии добавляют сухой цикорий. При необходимости к эмульсии можно добавить дополнительный белок. Дополнительным белком может быть любой источник белка из перечисленных выше. Конкретный выбор будет зависеть от наличия резервов, стоимости и вкусовых качеств. Дополнительный белок можно добавлять в любом, пригодном для данной цели количестве. В одном из вариантов дополнительный белок может добавляться в количестве примерно от 5 до 35 мас.%.

При необходимости к эмульсии можно добавить жиры. Обычно количество жира в эмульсии должно контролироваться в целях облегчения процесса обработки и получения приемлемого продукта. Однако сам мясной материал может содержать требуемое количество жиров и, следовательно, в этом случае контроль может не понадобиться. Обычно на этой стадии эмульсия содержит максимальный уровень жира примерно 25 мас.%. В одном из вариантов количество жира в эмульсии предпочтительно колеблется примерно от 5 до 15 мас.%, более предпочтительно примерно от 7 до 12 мас.%. Массовое отношение белка к жиру в эмульсии составляет предпочтительно примерно от 1:1 до 7:1. В качестве дополнительных жиров могут использоваться любые, пригодные для данной цели животные жиры, такие как говяжий костный жир, либо это могут быть растительные жиры.

К эмульсии можно также добавить дополнительные ингредиенты, такие как сахара, соли, специи, приправы, ароматизаторы, минеральные вещества и т.п. В одном из вариантов количество добавляемых дополнительных ингредиентов колеблется примерно от 1 до 5 мас.% желированного зернового продукта.

Можно добавлять также воду для обеспечения влагосодержания эмульсии примерно от 45 до 80 мас.%. Если же мясной материал содержит достаточно влаги, то в этом случае воду можно не добавлять.

По окончании смешивания эмульсию предпочтительно пропускают через вакуум-шприц или аналогичный аппарат для деаэрации с целью деаэрации эмульсии. При этом удаляется воздух, который в противном случае может вызвать разрушение составленного по рецептуре эмульсионного продукта и ухудшить его "мясной" вид. Затем эмульсия поступает в эмульсионный измельчитель, где она подвергается быстрому воздействию механического усилия сдвига и нагрева. Для этой цели можно использовать любой пригодный эмульсионный измельчитель, включая, например, эмульсионный измельчитель, описанный в патенте США 5132137. Промышленностью выпускаются также и другие, пригодные для данной цели эмульсионные измельчители под торговым названием TRIGONAL от фирмы Seifer Maschinenfabrik GmbH & Со. KG, Bahnhofstrasse 114, Postfach 101008, Velbert 1, Germany.

Температура эмульсии в эмульсионном измельчителе может повыситься до требуемой температуры коагуляции всего за несколько секунд. В одном из вариантов температура коагуляции колеблется примерно от 100 до 120°С. В одном из вариантов температура коагуляции колеблется примерно от 45 до 75°С, как описано в патенте США 5132137. В большинстве случаев механической энергии, генерируемой в эмульсионном измельчителе, бывает достаточно для нагрева эмульсии до требуемой температуры, но эту энергию можно дополнить за счет прямой инжекции перегретого пара.

Из эмульсионного измельчителя нагретая эмульсия может подаваться в трубчатый выдерживатель. В трубчатом выдерживателе по мере медленного продвижения нагретой эмульсии через него происходит коагуляция эмульсии. Время пребывания нагретой эмульсии в трубчатом выдерживателе достаточно для ее коагуляции с образованием плотного эмульсионного продукта на выходе из трубчатого выдерживателя. Затем плотный эмульсионный продукт поступает из трубчатого выдерживателя в машину для разрезки его на куски, например крупные куски, размером, пригодным для использования в кормах для домашних животных. По внешнему виду и текстуре куски напоминают мясо. При необходимости куски можно переработать в хлопья. Куски можно также использовать в рецептуре продукта типа соуса (куски в подливе). Известны и могут использоваться другие способы производства кусков, такие как экструзия кормовой смеси, варка кормовой смеси в паровой печи и разрезка вареного экструдата на куски.

Если требуется приготовить консервированный корм для домашних животных в форме мясного хлеба, то мясной фарш можно получить путем эмульгирования мясного материала, пригодного для получения мясной эмульсии. Мясной материал может быть любым, пригодным для данной цели источником мяса, например, как описано выше. К мясной эмульсии можно добавить пригодные для данной цели желирующие агенты, включая камеди, такие как каппа-каррагинан, камедь из бобов рожкового дерева, гуаровая камедь, ксантановая камедь или др. В одном из вариантов используется примерно не более 2 мас.% камеди. Затем к мясной эмульсии добавляют сухой растительный материал, например цикорий.

К мясной эмульсии можно также добавить дополнительные ингредиенты, такие как сахара, соли, специи, приправы, ароматизаторы, минеральные вещества и т.п. При этом количество дополнительных ингредиентов должно быть предпочтительно таким, чтобы они составляли примерно от 0,25 до 5 мас.% мясного фарша. К мясной эмульсии можно добавить также воду для обеспечения влагосодержания в ней примерно от 70 до 85 мас.%. Если в самом мясном материале содержится достаточно влаги, то воду можно не добавлять.

Затем мясную эмульсию нагревают до температуры примерно выше 65°С в варочном аппарате-смесителе. При необходимости в мясной фарш может инжектироваться пар. После термообработки мясная эмульсия вновь подвергается эмульгированию с получением фарша для мясного хлеба; фарш для мясного хлеба выдерживается при температуре примерно выше 60°С перед последующей расфасовкой в консервные банки.

Следует заметить, что желированный зерновой продукт можно производить любым, пригодным для данной цели способом, а не только описанными выше способами. В желированный зерновой продукт могут также вводиться другие виды олигосахаридов, такие как фруктоолигосахариды и олигосахариды сои. Олигосахариды сои могут добавляться в виде соевой муки или другого, пригодного для данной цели соевого источника.

Зерновые продукты могут быть в любом виде, например сухими, полувлажными и влажными. Однако матрица, формирующая зерновой продукт, должна быть обязательно подвергнута клейстеризации, с тем, чтобы удалить или разрушить сесквитерпеновые соединения, которые могут присутствовать в растительном материале. Следует подчеркнуть, что зерновой продукт согласно настоящему изобретению может быть приготовлен для пищевых и/или кормовых целей.

Ниже приводятся примеры кормов для домашних животных, приготовленных в соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения, которые, однако, не ограничивают сущности изобретения.

Пример 1: Сухой корм для домашних животных

Кормовую смесь готовили из примерно 58 мас.% кукурузы, 6 мас.% кукурузного глютена, 23 мас.% мяса и остальных компонентов - муки, сухого цикория, солей, витаминов и минеральных веществ. Сухой цикорий использовали в виде экстракта цикория, который был получен согласно одному из вариантов настоящего изобретения и добавлен в количестве примерно 5% или менее. Приготовленную кормовую смесь направляли в установку для предварительного кондиционирования и увлажняли. Затем увлажненный корм подавали в аппарат экструзионной варки, где происходила клейстеризация. Клейстеризованную матрицу на выходе из экструдера продавливалась через экструзионную головку с получением экструдата. Экструдат нарезали кусочками, пригодными для скармливания собакам, высушивали при температуре примерно 110°С в течение примерно 20 минут и охлаждали с образованием гранул. Следует заметить, что часть или все количество используемой жировой смеси или жира и масел можно добавлять на более поздней стадии, например, в качестве покрытия.

Добавленный цикорий способен улучшить здоровье домашних животных, например предупредить и/или излечить воспаление, что обсуждалось выше.

Пример 2: Сухой корм для домашних животных

Сухой корм для домашних животных готовили аналогично сухому корму для домашних животных в примере 1. Однако он включал дополнительный ингредиент, традиционно используемый для улучшения вкусовых качеств сухого корма, пригодного для кошек. Добавленный цикорий способен улучшить здоровье домашних животных, например предупредить и/или излечить воспаление, что обсуждалось выше.

Пример 3: Сухой корм для кошек

Кормовую смесь готовили из примерно 58 мас.% кукурузы, 6 мас.% кукурузного глютена, 23 мас.% муки из отходов переработки птицы и остальные компоненты - сухой цикорий, соли, витамины и минеральные вещества. Цикорий добавляли в количестве примерно 5% или менее. Как обсуждалось выше, добавленный цикорий может ингибировать ферментную активность, что, как предполагается, способствует улучшению здоровья животного, например лечению и/или предупреждению воспаления.

Кормовую смесь подавали в установку для предварительного кондиционирования и увлажняли. Увлажненный корм поступал затем в аппарат для экструзионной варки, где происходила клейстеризация. Клейстеризованная матрица на выходе из экструдера продавливалась через экструзионную головку с получением экструдата. Экструдат нарезали кусочками, пригодными для скармливания кошкам, сушили при температуре примерно 110°С в течение примерно 20 минут и охлаждали с образованием гранул. На этой стадии на гранулы наносили полученный лиофильной сушкой сухой концентрат одного или более штаммов бактерий Lactobacillus, например Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) и Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Указанный сухой бактериальный концентрат наносили на гранулы в достаточном количестве, обеспечивающем потребление кошкой примерно от 1,0Е+07 до 1,0Е+9 КОЕ (колониеобразующих единиц) в сутки. При этом часть сухого бактериального концентрата смешивали с первой массой гранул, которые затем упаковывали в пакеты. Вторую порцию сухого бактериального концентрата взвешивали и смешивали с носителем липидов; полученную смесь напыляли на вторую массу гранул. Гранулы упаковывали в пакеты после достаточной просушки покрытия при 50-60°С в течение нескольких минут.

Пример 4: Консервированный корм и добавка для домашних животных

Готовили смесь из примерно 73% тушек птицы, свиных легких и говяжьей печени (в измельченном виде), 16% пшеничной муки, 2% красителей, витаминов и неорганических солей. Полученную смесь эмульгировали при 12°С и экструдировали в виде пудинга. К эмульсии добавляли сухой цикорий в виде экстракта, приготовленного согласно одному из вариантов настоящего изобретения, в количестве примерно 5% или менее. Затем эмульсию подвергали варке при температуре 90°С, после чего охлаждали до 30°С и нарезали на куски. Примерно 45% кусков смешивали с примерно 55% соуса, приготовленного из примерно 98% воды, 1% красителя и 1% гуаровой камеди. Смесь кусков с соусом расфасовывали в консервные банки из белой жести и стерилизовали при 125°С в течение примерно 40 минут.

В качестве пробиотической добавки, подлежащей смешиванию с кормом для домашних животных перед приготовлением порции для скармливания животному, была предусмотрена дополнительная упаковка в форме саше со штаммами следующих видов Lactobacillus: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) или Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Соответствующее потребление добавки домашним животным составляет примерно от 106 до 1012 КОЕ/сутки в зависимости от вида домашнего животного, т.е. кошка или собака, и от физических факторов домашнего животного, таких как, например, масса тела. Добавку упаковывали таким образом, чтобы она была доступно прикреплена к консервной банке вместе с инструкцией по кормлению.

Приведенные ниже в качестве примера (не ограничивающего сущности настоящего изобретения) и подробно описанные испытания проводились с целью подтверждения эффективности настоящего изобретения.

Испытания in vitro: тест 1

Авторы заявки провели ряд экспериментальных тестов для подтверждения полезного действия настоящего изобретения. Готовили культуры клеток, выделенных у пациентов, больных раком толстой кишки, и обрабатывали их различным количеством экстрактов цикория в течение примерно 48 часов с целью оценки влияния цикория на циклооксигеназную активность. Методики подготовки образцов и проведения тестов, а также результаты тестов более подробно обсуждаются ниже.

Приготовление культур клеток

Линия раковых клеток толстой кишки НТ-29 была получена из American Type Culture Collection; клетки культивировали в среде МакКои 5А с добавлением 10% сыворотки крови эмбриона крупного рогатого скота (FBS), 25 мг/мл гентамицина. Клетки НТ-29 обрабатывали рядом различных экстрактов цикория, приготовленных в соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения, что подробно обсуждается ниже.

Приготовление экстрактов цикория

Четыре различных экстракта цикория, а именно экстракты A-D, готовили в соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения. Сначала каждый из образцов цикория массой 40 и 10 граммов (г), измельченных в порошок, просеивали через сито с размером отверстий 0,5 мм. Затем образцы подвергали обработке с целью удаления жира путем смешивания их с гексаном в течение примерно тридцати минут при комнатной температуре. К просеянному образцу цикория массой 40 г добавляли 600 миллилитров (мл) гексана, к просеянному образцу цикория массой 10 г - 150 мл гексана. Гексан выпаривали под вакуумом примерно при 50°C с получением экстракта А.

Экстракт В получали путем предварительного обезжиривания 40 г измельченного в порошок цикория, как обсуждалось выше. Обезжиренный образец гидролизовали в 300 мл кислоты, например HCl, на кипящей водяной бане в течение примерно 20 минут. После охлаждения и центрифугирования (8000 об/мин, 5 минут, 10°С) раствор экстрагировали 150 мл растворителя, такого как этилацетат промышленного производства, например, от фирмы MERCK. Растворитель выпаривали до сухости. После последующей сушки над безводным сульфатом натрия в условиях вакуума примерно при 50°С получали экстракт В.

Экстракты С и D получали следующим образом. Сначала образец измельченного в порошок цикория массой 10 г обезжиривали, как описано выше. Вторую часть обезжиренного порошка экстрагировали смесью из примерно 250 мл растворителя/воды, взятых в объемном соотношении 1:1 МеОН и воды в растворе. Экстракцию проводили в условиях перемешивания при комнатной температуре (напр., примерно при 20-25°С) в течение примерно 30 минут. После центрифугирования раствор разделяли на два равных объема. Из первой объемной части раствора, органический растворитель выпаривали под вакуумом примерно при 50°С. Оставшуюся водную фазу сушили методом сублимационной сушки с получением экстракта С.

Вторую объемную часть раствора обрабатывали примерно 2 г поливинилполипирролидона в условиях перемешивания в течение примерно 30 минут с целью улавливания полифенолов. Адсорбент удаляли фильтрацией, центрифугированием или аналогичным способом. Органический растворитель выпаривали под вакуумом примерно при 50°С. Оставшуюся водную фазу сушили методом сублимационной сушки с получением экстракта D.

Измерение образования PGE2

Оценку влияния различных экстрактов цикория, а именно экстрактов А-С, на биосинтез PGE2 проводили на линии раковых клеток НТ-29, выделенных у пациентов, больных раком толстой кишки. Биосинтез PGE2 служит показателем уровня ферментной активности, например циклооксигеназной активности, поскольку общеизвестно, что циклооксигеназа может действовать как катализатор процесса образования PGE2, например, из арахидоновой кислоты. Поэтому влияние экстракта цикория на ферментную активность циклооксигеназы можно оценивать по результатам данного эксперимента, как описано ниже.

Клетки выращивали в течение 48 часов на пригодных для их роста средах с добавлением 0,1% альбумина сыворотки крови крупного рогатого скота (BSA) и 10 мкМ арахидоновй кислоты. Затем к указанным средам добавляли экстракты цикория в концентрациях 50, 100 и 200 мкг/мл в течение либо 21 часа либо 15 часов. Другую линию образцов клеток готовили путем добавления экстракта цикория В к клеткам НТ-29, как обсуждалось выше, с последующим совместным инкубированием в течение 6 часов в присутствии 10 нг/мл TNF-α (фактор некроза опухоли-альфа). Предполагается, что добавление TNF будет стимулировать воспаление.

Количество PGE2 в средах для роста клеток определяли с применением готового набора для моноклональной ферментативной иммунопробы на PGE2 (от фирмы Cayman Chemical) согласно инструкциям изготовителя. Если говорить кратко, то 25 или 50 мкл среды наряду со стандартными образцами PGE2 серийного разбавления смешивали с соответствующим количеством радиоактивно меченой ацетилхолинэстеразы и антисыворотки PGE2 и инкубировали при комнатной температуре в течение 18 часов. После осушения лунок и ополаскивания промывным буферным раствором добавляли 200 мкл реактива Эльмана, который содержал субстрат для ацетилхолинэстеразы. Ферментативную реакцию проводили в медленно встряхивающем устройстве при комнатной температуре в течение 1 часа. Результаты измеряли с помощью считывающего устройства для микропластинок при 415 нм и пересчитывали в микрограммы белка.

Результаты теста показали, что экстракт В цикория, приготовленный с этилацетатом, как описано ранее, оказал наиболее выраженное действие на ингибирование циклооксигеназной активности, о чем судили по уменьшению измеренного количества PGE2. В большинстве случаев снижение циклооксигеназной активности было более выраженным по мере увеличения количества экстракта цикория. Кроме того, результаты теста показали, что экстракт В цикория оказал более выраженное действие на ингибирование циклооксигеназной активности в линии клеток НТ-29 в присутствии TNF по сравнению с линией клеток НТ-29 без TNF. Это позволяет предположить, что на ингибирование общей циклооксигеназной активности более существенное влияние оказывает специфическое ингибирование циклооксигеназы-2 по сравнению с циклооксигеназой-1. Результаты теста представлены в таблице 1.

Таблица 1:
Влияние экстрактов цикория, полученных с этилацетатом, на синтез PGE2 в клетках НТ-29
ДобавлениеУровень PGE2 (% от контроля) -TNF-αУровень PGE2 (% от контроля) +TNF-α*
Контроль (только растворитель)100100
Экстракт В цикория (100 мкг/мл)9580
Экстракт В цикория (200 мкг/мл)330.7
* Стимуляция ферментной активности TNF-α была 10-кратной.

Испытания in vitro: Тест 2

1. Ингибирующее действие α-СН2-γ-бутиролактона на синтез PGE2

Авторы заявки провели аналогичный экспериментальный тест для подтверждения противовоспалительного действия альфа-метилен-гамма-бутиролактона. Ингибирование синтеза PGE2 альфа-метилен-гамма-бутиролактоном большей частью было показано на примере клеток НТ-29, стимулированных TNF-α. С этой целью клетки культивировали и пересевали в среду МакКои 5А с добавлением арахидоновой кислоты (10 микролитров) и альбумина сыворотки крови крупного рогатого скота (0,01%). Клетки обрабатывали в течение 6 часов альфа-метилен-гамма-бутиролактоном (растворенным в метиловом спирте) в следующих дозах: 15, 30, 60 микроМ или только растворителем в течение 21 часа со стимуляцией TNF-α (10 нг/мл) или без нее. Анализ PGE2 проводили методом ELISA на образце среды.

Таблица 2:
Концентрация PGE2 в пг/мл среды в клетках НТ-29, обработанных α-СН2-γ-бутиролактоном с добавлением или без добавления TNF-α
пг РGЕ2/мл среды - TNF-α% от контроляпг РGЕ2/мл среды +TNF-α% от контроля
Метиловый спирт (контроль)259410018941730
α-СН2-γ-бутиролактон 15 мкМ281410813286512
α-СН2-γ-бутиролактон 30 мкМ1970769349360
α-СН2-γ-бутиролактон 60 мкМ114414131050

2. Ингибирующее действие α-СН2-γ-бутиролактона на экспрессию СОХ-2

Вестерн блоттинг анализ: лизаты клеток получали путем обработки клеток НТ-29 (обработка проводилась так же, как и при определении PGE2, см. выше, т.е. в присутствии или в отсутствие TNF-α с или без α-СН2-γ-бутиролактона) буфером для лизиса (150 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl с рН 8, 1% Tween 20, 1 мМ ЭДТА с рН 8, ингибиторы протеаз, PEFA (от фирмы Merck), DETC (от фирмы Aldrich)). Лизаты обрабатывали ультразвуком в течение 5 с и центрифугировали при 10000 g в течение 5 мин. Концентрацию белка оценивали методом Брэдфорда, стандартизированным с использованием альбумина сыворотки крови крупного рогатого скота.

Экстракты целых клеток (25 мкг) кипятили в буферной системе Лэммли (Laemmli) и разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с использованием дискретной системы полиакриламидного геля. Неспецифические места связывания блокировали путем инкубирования мембраны в течение ночи при 4°С в забуференном фосфатным буфером солевом растворе (PBS) с 5% сухого молока, содержащем 0,1% Tween-20.

Блоты гибридизировали в 1:1000 разбавлении поликлонального антитела СОХ-2, а также антитела СОХ-1 из плазмы крови коз (С-20, Santa Cruz Biotechnology) в PBS с 5% сухого молока в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей промывкой в течение 1 ч в PBS с 5% сухого молока с последующей промывкой в течение 1 ч в PBS с 1% сухого молока.

Затем блоты опробовали с вторичньми антикозьими антителами из плазмы крови осла, конъюгированными с пероксидазой хрена. После промывки в течение 1 ч для обнаружения комплекса использовали готовый набор реактивов ECL для вестерн блоттинг анализа (от фирмы Amersham).

Результаты показаны на фиг.1.

3. Специфическое ингибирование СОХ-2-активности α-СН2-γ-бутиролактоном

Готовый набор реактивов для определения циклооксигеназной активности Stressgen StressXpress™ обеспечивает метод измерения специфической активности циклооксигеназ СОХ-1 и СОХ-2 во многих биологических жидкостях. В наборе используется специфичный хемилюминесцентный субстрат (молекулы ароматических углеводородов) для обнаружения пероксидной активности ферментов СОХ. После ингибирования специфическими соединениями (α-СН2-γ-бутиролактоном и NS-398 (специфичный ингибитор СОХ-2 от фирмы Cayman Chemical Company), растворенными в метиловом спирте) измеряли прямую остаточную активность циклооксигеназ путем добавления хемилюминесцентного субстрата и арахидоновой кислоты (50 мкМ). Световое излучение начиналось сразу же; хемилюминесцентный сигнал (относительные единицы люминесценции - RLU) измеряли спустя 30 минут (с помощью люменометра Tecan). Количество светового излучения прямо пропорционально активности СОХ.

В этом тесте установлено, что α-СН2-γ-бутиролактон является специфическим и сильнодействующим ингибитором СОХ-2-активности, как и контрольное соединение NS-398. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3:
Измерение активности циклооксигеназ (СОХ-1, СОХ-2)
СОХ-1 активность (RLU)% от контроляCOX-2 активность (RLU)% от контроля
Только растворитель (метиловый спирт)411510026450100
α-СН2-γ-бутиролактон (40 мкМ)48071171282349
NS-398 (1 мМ)40639917947

Само собой разумеется, что специалисты в данной области могут вносить различные изменения и модификации в приведенные здесь предпочтительные варианты изобретения. Эти изменения и модификации можно вносить без нарушения духа и масштабов настоящего изобретения и без преуменьшения его предполагаемых преимуществ. То есть предполагается, что указанные изменения и модификации возможны только в рамках заявленной формулы изобретения.

1.Пищеваякомпозициядляснижениярискавоспаления,содержащаякрахмальнуюматрицуиэкстрактцикория,содержащийтерапевтическиэффективноеколичествоα-метилен-γ-бутиролактона,способногоингибироватьферментнуюактивность,связаннуюсциклооксигеназой,итранскрипционнуюактивностьСОХ-2ворганизмемлекопитающего.12.Пищеваякомпозициядляпредупрежденияилилечениявоспаления,содержащаяэкстрактцикория,содержащийтерапевтическиэффективноеколичествоα-метилен-γ-бутиролактона.23.Кормоваякомпозициядляснижениярискавоспаления,содержащаякрахмальнуюматрицуиэкстрактцикория,содержащийтерапевтическиэффективноеколичествоα-метилен-γ-бутиролактона,способногоингибироватьферментнуюактивность,связаннуюсциклооксигеназой,итранскрипционнуюактивностьСОХ-2ворганизмемлекопитающего.34.Кормоваякомпозициядляпредупрежденияилилечениявоспаления,содержащаяэкстрактцикория,содержащийтерапевтическиэффективноеколичествоα-метилен-γ-бутиролактона.45.Применениеэкстрактацикория,содержащеготерапевтическиэффективноеколичествоα-метилен-γ-бутиролактона,дляприготовленияпищевойиликормовойкомпозициидляингибированияактивностиСОХ-2.5
Источник поступления информации: Роспатент

Всего документов: 604
Всего документов: 2

Похожие РИД в системе

Защитите авторские права с едрид