Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ УСКОРЕННОГО ЛИНЕЙНОГО ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ БУРКХОЛЬДЕРИЙ

Изобретение относится к медицине, лабораторной диагностике и касается обнаружения специфического антигенного комплекса возбудителей сапа и мелиоидоза.

Изобретение может быть использовано для дифференцирования патогенных Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei от непатогенных близкородственных буркхольдерий.

Изобретение может быть использовано для изучения иммунных сывороток к антигенам данных микроорганизмов и сывороток к антигенам непатогенных близкородственных буркхольдерий, а также для установления идентичности различных бактериальных антигенов.

В силу ряда причин до настоящего времени сохраняется повышенный интерес исследователей к изучению буркхольдерий, относящихся к группе «pseudomallei», и Burkholderia cepacia - комплексу. Возбудитель мелиоидоза является эндемичным для Юго-Восточной Азии, Северной Австралии, некоторых районов Африки, Северной и Центральной Америки. В ареалах обитания этот микроорганизм обычно выделяется из почвы и водоемов со стоячей водой. Клиническая картина заболевания у людей варьирует от острой септицемии до хронической или латентной инфекции. Показано, что уровень смертности от мелиоидоза в Северо-Восточном Таиланде достигает 50%, причем умирает 40% пациентов, получавших антибактериальные препараты, что связано со значительной устойчивостью возбудителя к антибиотикам (Harding S.V., Sarkar-Tyson М., Oyston P.C.F., Titball R.W. Immunogenic proteins of Burkholderia pseudomallei and uses thereof// Patent WO/2008/017826).

Возбудитель сапа способен передаваться от больных лошадей людям, профессионально занятым уходом за животными, алиментарным, аэрозольным или контактным путем (через кожные покровы) и вызывать острые и хронические заболевания, в том числе с летальным исходом. Заболевание до сих пор встречается в Азии, Африке, Южной и Центральной Америке, в западных странах случаи инфекции редки.

Установлено, что В. mallei и В. pseudomallei имеют сходное строение, в том числе и антигенный состав (Пивень Н.Н., Илюхин В.И. Патогенность Burkholderia pseudomallei как функция его внеклеточных и поверхностных антигенов // Журн. микробиол. - 2000. - №6. - С.94-99). Особенно высока вероятность заболевания указанными инфекциями у лиц, страдающих сахарным диабетом, алкоголизмом, или со сниженным иммунным статусом. Лечение часто безуспешно, вакцинопрофилактика не разработана (Sarkar-Tyson М., Titball R.W. Progress toward development of vaccines against melioidosis: A review // Clin. Ther. - 2010. - V.32, №8. - P.1437-1445). Кроме того, подтверждена возможность использования В. pseudomallei и В. mallei в качестве компонентов биологического оружия (Whitlock G.C., Robida M.D., Judy В.М. et al. Protective antigens against glanders identified by expression library immunization // Front Microbiol. - 2011. - №2. - P.227).

Burkholderia thailandensis входит в кластер из трех близкородственных микроорганизмов, характеризующихся высокой схожестью, включающий также В. pseudomallei и В. mallei. Однако В. thailandensis обладает гораздо меньшей вирулентностью и редко вызывает заболевания у человека, в связи с чем рекомендуется в качестве штамма-суррогата В. pseudomallei в ряде исследований (Morici L.A., Heang J.,Tate Т. et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to Burkholderia thailandensis aerosol infection // Microb. Pathog. - 2010. - V.48, №1. - P.9-17; Ngugi S.A., Ventura V.V., Qazi O. et al. // Vaccine. - 2010. - V.28, №47. - P.7551-7555). В частности, антиген из целых клеток В. thailandensis предлагают использовать в эндемичных районах для обнаружения у больных людей общих антител к В. pseudomallei с помощью иммунофлюоресцентного анализа (Puthucheary S.D., Anuar A.S., Tee T.S. Burkholderia thailandensis whole cell antigen cross-reacts with B. pseudomallei antibodies from patients with melioidosis in an immunofluorescent assay//Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. - 2010. - V.41, №2. - P.395-400).

Близкородственные бактерии В. cepacia-комплекса (В. cepacia и Burkholderia gladioli) обитают во внешней среде и не являются патогенными для здоровых людей. Однако они способны вызывать респираторные заболевания у пациентов с кистозным фиброзом, а также нозокомиальные инфекции у лиц, находящихся на лечении в палатах интенсивной терапии (Harding S.V., Sarkar-Tyson М., Oyston P.C.F., Titball R.W. Immunogenic proteins of Burkholderia pseudomallei and uses thereof // Patent WO/2008/017826). Значительное родство буркхольдерий подтверждается в экспериментах по получению моноклональных антител. Так, мышиные моноклональные антитела к соматическому антигену 64 kDa В. cepacia из испытанного широкого спектра других бактерий давали перекрестные реакции только со штаммами В. pseudomallei, В. mallei и В. gladioli (Otterbein С.К., Splettstoesser W.D., Linde H.J. et al. Development and characterization of a murine monoclonal antibody reactive with a 64 kDa somatic antigen of Burkholderia cepacia/fHybridoma. - 1998. - V.17, №2. - P.143-150).

В связи с вышеизложенным представляют интерес методы, позволяющие отличать патогенные В. pseudomallei и В. mallei от близкородственных непатогенных в обычных условиях буркхольдерий.

Близким решением является предложенный Пивень Н.Н. с соавт. способ выявления перекрестно-реагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза в ДСН-ПААГ электрофорезе (Пивень Н.Н., Тимошин В.Б., Алексеев В.В. и др. Способ выявления перекрестнореагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза // Патент №2286576 от 27.10.2006 г.). Авторы указывают на значительную схожесть антигенных спектров близкородственных видов В. mallei, В. pseudomallei и В. thailandensis, поэтому данный метод позволяет выявлять у них индивидуальные белковые антигены, но не дифференцировать бактериальные виды друг от друга.

Предложен способ дифференцирования патогенных возбудителей мелиоидоза и сапа от непатогенных для людей буркхольдерий и близкородственных микроорганизмов путем выявления в составе микробных клеток поверхностного антигенного комплекса в ракетном иммуноэлектрофорезе (Корсакова И.И., Напалкова Г.М., Храпова Н.П. и др. Способ дифференцирования патогенных от непатогенных буркхольдерий // Патент №2378360 от 10.01.2010 г.). Применение метода может быть несколько ограничено в связи с использованием специфической сыворотки иммунной козьей, содержащей антитела к данному комплексу.

Наиболее близким аналогом изучения сывороток и разных образцов антигенов является метод линейного иммуноэлектрофореза (ЛИЭФ), предложенный И. Креллем (Аксельсен Н., Крелль И., Вееке Б. Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу. Методы и применение // М.: Мир, 1977. - 216 с). Авторы использовали метод для определения характеристик большинства белков нормальных и патологических сывороток крови человека и для получения специфических сывороток иммунизацией чистыми комплексами антиген-антитело, выделенными методом линейного иммуноэлектрофореза. Для этих целей линейный иммуноэлектрофорез проводили в течение 18 ч при напряженности электрического поля (Н) 1,5 В/см при температуре 10°С.

Целью изобретения является разработка способа ускоренного ЛИЭФ для дифференцирования патогенных возбудителей сапа и мелиоидоза от непатогенных близкородственных буркхольдерий.

Поставленная цель достигается выявлением в составе микробных клеток специфического высокомолекулярного антигенного комплекса с м.м. не ниже 336 kDa с помощью иммунных сывороток кроличьих или козьих, с титром антител в РИД не ниже 1:16, полученных иммунизацией водно-солевыми экстрактами (ВСЭ) из ацетон-высушенных клеток штаммов В. pseudomallei 100 или В. mallei 10230, предварительно обработанных ультразвуком 2 раза в течение 2 мин при 50 Гц с охлаждением.

Авторами изобретения предпринимались попытки проводить дифференцирование патогенных буркхольдерий от непатогенных с помощью линейного иммуноэлектрофореза, используя различные условия его постановки. Были испытаны несколько буферных растворов с ионной силой 0,016-0,032 (трис-вероналовый с лактатом кальция, рН 8,6; барбитал-трис-глициновый, рН 8,8). Варьировали величину напряженности электрического поля (2-12 В/см), длительность (0,5-18 ч), температуру (10-25°С).

В процессе исследований были подобраны следующие условия постановки ЛИЭФ: пластинку фирмы «GelBond», размером 8,5×10 см, заливают 10 мл 1% раствора агарозы фирмы «Calbiochem», приготовленного на трис-вероналовом буфере, содержащем 0,1 г лактата кальция и 0,7 г азида натрия в 1 л буфера, рН 8,6, разведенном в 5 раз (этот же буфер используется в электродных отсеках). На расстоянии 1 см от края пластинки с анодной стороны вырезают полосу геля шириной 4-5 см. Гель растапливают, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 5-10 об.% сыворотки, содержащей антитела к исследуемым антигенам, и снова заливают на пластинку. Между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 1-2 мм. После застывания геля с сывороткой на границе с контактной полосой располагают прямоугольные гель-образцы с антигенами, подлежащими исследованию. Гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 5-10 об.% исследуемых антигенов. К краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером. Электрофорез проводят при напряженности электрического поля - 4-5 В/см в течение 3-5 ч при комнатной температуре. После остановки электрофореза пластинки просматривают. Наличие линий преципитата на границе гель-образца и геля с сыворотками иммунными кроличьими или козьими, содержащими антитела к искомому антигенному комплексу, при данных условиях ЛИЭФ свидетельствует о присутствии антигенов патогенных В. pseudomallei и В. mallei. Отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных микроорганизмов, что позволяет дифференцировать возбудители сапа и мелиоидоза от непатогенных близкородственных буркхольдерий.

Исследование по этому признаку штаммов методом ускоренного линейного иммуноэлектрофореза в данной модификации с антителами, полученными к ВСЭ из ацетон-высушенных клеток возбудителей сапа и мелиоидоза, может быть использовано при изучении антигенного материала и сывороток. Наличие непрерывных преципитационных линий, образуемых расположенными рядом гель-образцами, свидетельствует об идентичности исследуемых антигенов.

Примеры конкретного выполнения, подтверждающие осуществление предлагаемого способа.

Пример 1. Дифференцирование патогенных штаммов В. mallei и В. pseudomallei от близкородственных буркхольдерий.

Линейный иммуноэлектрофорез проводят на пластинке фирмы «GelBond», размером 8,5×10 см, заливают 10 мл 1% раствора агарозы фирмы «Calbiochem», приготовленного на трис-вероналовом буфере, содержащем 0,1 г лактата кальция и 0,7 г азида натрия в 1 л буфера, рН 8,6, разведенном в 5 раз (этот же буфер используется в электродных отсеках). На расстоянии 1 см от края пластинки с анодной стороны вырезают полосу геля шириной 4 см. Гель растапливают, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 10 об.% сыворотки (кроличьей или козьей), содержащей антитела к исследуемым антигенам, и снова заливают на пластинку. Между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 1,5 мм. После застывания геля с сывороткой на границе с контактной полосой располагают прямоугольные гель-образцы с антигенами, подлежащими исследованию (ВСЭ из ацетон-высушенных клеток): В. thailandensis 264, 294, В. gladioli 8495, 1298, В. cepacia 25416, В. mallei 10230, В. pseudomallei 100. Гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 10 об.% исследуемых антигенов. К краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером. Условия электрофореза: напряженность электрического поля - 4,8 В/см, время электрофореза - 4,5 ч при комнатной температуре. После остановки электрофореза пластинки просматривают.

Наличие линий преципитата на границе гель-образца и геля с сыворотками иммунными свидетельствует о присутствии антигенов патогенных В. mallei и В. pseudomallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных буркхольдерий.

Пример 2. Дифференцирование патогенных штаммов В. mallei и В. pseudomallei от близкородственных буркхольдерий и установление идентичности антигенов.

Линейный иммуноэлектрофорез проводят, как описано в примере 1. В гель добавляют 5 об.% сыворотки козьей к В. mallei 10230. Гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 5 об.% исследуемых антигенов: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. cepacia 25416, В. pseudomallei 57576, В. mallei Ц-4, В. thailandensis 264. Между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 2 мм. К краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером. Условия электрофореза: напряженность электрического поля - 4,2 В/см, время электрофореза - 5 ч при комнатной температуре. После остановки электрофореза пластинки просматривают.

Наличие линий преципитата на границе гель-образца и геля с сыворотками иммунными свидетельствует о присутствии антигенов патогенных В. mallei и В. pseudomallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных буркхольдерий; наличие непрерывных преципитационных линий, образуемых расположенными рядом гель-образцами, свидетельствует об идентичности исследуемых антигенов штаммов В. mallei и В. pseudomallei.

Пример 3. Обнаружение общих антигенов у патогенных и непатогенных буркхольдерий.

Линейный иммуноэлектрофорез проводят, как описано в примере 1. В гель добавляют 10 об.% сыворотки кроличьей к В. mallei 10230. Гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 10 об.% исследуемых антигенов: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. pseudomallei 100, В. mallei 10230, В. thailandensis 264. Между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 1 мм. К краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером. Условия электрофореза: напряженность электрического поля - 4,5 В/см, время электрофореза - 50 мин при комнатной температуре. После остановки электрофореза пластинки просматривают.

Линии преципитата на границе гель-образца и геля с сывороткой иммунной отсутствуют; наличие на расстоянии 5 см от контактной полосы непрерывных преципитационных линий, образуемых расположенными рядом гель-образцами, свидетельствует об идентичности исследуемых общих антигенов штаммов В. mallei, В. pseudomallei и В. thailandensis.

Пример 4. Обнаружение общих и специфических антигенов у патогенных и непатогенных буркхольдерий в ускоренном линейном иммуноэлектрофорезе.

Линейный иммуноэлектрофорез проводят, как описано в примере 1. В гель добавляют 10 об.% сыворотки кроличьей к В. pseudomallei 100. Гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 10 об.% исследуемых антигенов: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. pseudomallei 57274, 60913, В. mallei 10230, В. cepacia 25416. Между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 2 мм. К краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером. Условия электрофореза: напряженность электрического поля - 4,2 В/см, время электрофореза - 3,5 ч при комнатной температуре. После остановки электрофореза пластинки просматривают.

Наличие линий преципитата на границе гель-образцов и геля с сывороткой иммунной свидетельствует о присутствии антигенов патогенных В. pseudomallei и В. mallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных буркхольдерий; непрерывные преципитационные линии свидетельствуют об идентичности исследуемых антигенов штаммов В. mallei и В. рseudomallei; наличие на расстоянии 5 см от контактной полосы непрерывных преципитационных линий показывает идентичность исследуемых общих антигенов штаммов В. mallei, В. pseudomallei и В. cepacia.

Краткое описание рисунков.

На рис.1 приведены результаты изучения патогенных и непатогенных буркхольдерий в ускоренном линейном иммуноэлектрофорезе при напряженности электрического поля - 4,8 В/см, длительности электрофореза - 4,5 ч при комнатной температуре. Использованы сыворотка кроличья к В. pseudomallei 100 и антигены: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. thailandensis 264 (1), В. gladioli 8495 (2), В. cepacia 25416 (3), В. mallei 10230 (4).

На рис.2 приведены результаты изучения патогенных и непатогенных буркхольдерий в ускоренном линейном иммуноэлектрофорезе при напряженности электрического поля - 4,8 В/см, длительности электрофореза - 4,5 ч при комнатной температуре. Использованы сыворотка козья к В. mallei 10230 и антигены: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. pseudomallei 100 (1), В. gladioli 1298 (2), В. thailandensis 294 (3), В. cepacia 25416 (4).

На рис.3 приведены результаты дифференцирования патогенных и непатогенных буркхольдерий и установления идентичности антигенов в ускоренном линейном иммуноэлектрофорезе при напряженности электрического поля - 4,2 В/см, длительности электрофореза - 5 ч при комнатной температуре. Использованы сыворотка козья к В. mallei 10230 и антигены: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. cepacia 25416 (1), В. pseudomallei 57576 (2), В. mallei Ц-4 (3), В. thailandensis 264 (4).

На рис.4 приведены результаты обнаружения общих антигенов у патогенных и непатогенных буркхольдерий в ускоренном линейном иммуноэлектрофорезе при напряженности электрического поля - 4,5 В/см, длительности электрофореза - 50 мин при комнатной температуре. Использованы сыворотка кроличья к В. pseudomallei 100 и антигены: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. pseudomallei 100 (1), В. thailandensis 264 (2), В. mallei 10230 (3).

На рис.5 приведены результаты обнаружения общих и специфических антигенов у патогенных и непатогенных буркхольдерий в ускоренном линейном иммуноэлектрофорезе при напряженности электрического поля - 4,2 В/см, длительности электрофореза - 3,5 ч при комнатной температуре. Использованы сыворотка кроличья к В. pseudomallei 100 и антигены: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. pseudomallei 57274 (1), В. mallei 10230 (2), В. cepacia 25416 (3), В. pseudomallei 60913 (4).

Таким образом, разработан способ ускоренного линейного иммуноэлектрофореза для дифференцирования патогенных возбудителей сапа и мелиоидоза, относящихся к особо опасным микроорганизмам, от непатогенных близкородственных буркхольдерий за счет изменения условий его проведения (напряженности электрического поля, длительности, температуры и состава буферного раствора) с сывороткой, полученной к В. pseudomallei 100 или к В. mallei 10230, который отличает простота и быстрота исполнения, наглядность, возможность определения общих и специфических антигенов буркхольдерий, отбора иммунных сывороток, содержащих антитела к соответствующим антигенам, возможность количественной оценки результатов, отсутствие потребности в сложном оборудовании. Данный способ может применяться как дополнительный аналитический метод выявления антигенов патогенных буркхольдерий.