Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПОРОВОЙ КУЛЬТУРЫ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО ШТАММА Bacillus sp. 1839

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и может быть использовано для производства спорового материала из бактерий Bacillus sp. 1839.

Известен способ получения спор из бактерий Bacillus weihenstephanensis KBAB4 (Baril Е., Coroller L., Postollec F. et al. The wet-heat resistance of Bacillus weihenstephanensis KBAB4 spores produced in a two-step sporulation process depends on sporulation temperature but not on previous cell history. International Journal of Food Microbiology. v. 146. 2011. P. 57-62). Способ включает засев жидкой питательной среды 0,1 мл бактерий в 100 мл среды Bacillus weihenstephanensis KBAB4 и культивирование вегетативных клеток бактерий на жидкой питательной среде от 6 до 100 часов при одной из указанных температур: 10°, 20° или 30°С до достижения концентрации 6×10⁷ кл/мл, затем бактерии центрифугируют при 6000×g, 10 мин, 12°С, и для индукции спорообразования переносят полученную бактериальную массу в фосфатный буфер с добавлением минеральных солей следующего состава: K₂HPO₄·3H₂O: 4.5 г/л; безводный KH₂PO₄: 1.8 г/л, с добавлением CaCl₂·2H₂O 8.0 мг/л, MnSO₄·H₂O 1.5 мг/л; рН 7.2, в котором выдерживают от 4 до 20 дней при постоянном перемешивании 100 об/мин при 10, 20 или 30°С до образования спор. Споры отделяют от минерального буфера центрифугированием при 6000×g в течение 10 мин, 12°С.

К недостаткам данного способа следует отнести:

1) переход культуры в споровое состояние занимает до 20 дней, длительное культивирование ведет к удорожанию процесса производства, в том числе увеличивает энергозатраты на электроэнергию, содержание оборудования, увеличивает риск контаминации сопутствующей микрофлорой;

2) использование фосфатного буфера с добавлением минеральных солей указанного состава не позволяет получить споры из морского штамма Bacillus sp. 1839;

3) скорость центрифугирования для отделения биомассы бактерий (6000×g) является жестким условием и не подходит для морского штамма Bacillus sp. 1839, так как при указанной скорости может произойти разрушение спор;

4) необходимость поддержания при культивировании предложенных температур (10°C или 30°C), в конечном результате, не только усложняет способ получения споровой культуры, но и требует дополнительных трудозатрат.

Задачей заявляемого технического решения является разработка способа получения спорового материала на основе морского штамма микроорганизмов Bacillus sp. 1839, снижение длительности процесса и трудозатрат.

Поставленная задача достигается новым способом получения спорового материала на основе штамма Bacillus sp. 1839, предусматривающим культивирование бактерий, отделение биомассы бактерий от жидкой питательной среды центрифугированием, добавление в полученную биомассу бактерий фосфатного буфера, в качестве которого используют гипертонический фосфатный буферный раствор следующего состава: хлорид калия 0,2 г/л, гидрофосфат натрия 3,3 г/л, дигидрофосфат калия 0,166 г/л, хлорид натрия от 46,334 до 56,334 г/л; инкубирование в нем бактерий до образования спор в течение 15-60 мин при комнатной температуре и осаждение полученных спор центрифугированием.

Использование в качестве источника для получения спорового материала бактерий штамма Bacillus sp. 1839 обеспечивает получение культуры продуцента-тетродотоксина с высоким содержанием эндоспор и свободных спор. Установлено, что эндоспоры накапливают большие количества токсина, что позволяет концентрировать ТТХ в спороносящих клетках и в свободных спорах. В связи с накоплением тетродотоксина в эндоспорах и свободных спорах при получении его из эндоспор и свободных спор отпадает необходимость дополнительной отчистки токсина от питательной среды.

Bacillus sp. 1839 - тетродотоксин-продуцирующие бактерии, выделенные из морских червей (Nemertea). Штамм Bacillus sp. 1839 является аэробной спорообразующей бактерией. Вегетативные клетки имеют форму прямых одиночных палочек, длиной 2.48-2.78 мкм и шириной 0.42-0.44 мкм. Под воздействием неблагоприятных факторов, а также при истощении питательных веществ в среде вегетативные клетки переходят в споровое состояние. Образующиеся споры имеют сферическую форму длиной 0.78-1.27 мкм, шириной 0.37-0.75 мкм. Существует большое количество токсинов, выделяемых спорообразующими бактериями, в том числе и веществ, действующих на клетки (фосфолипазы, гемолизины) и ткани (коллагеназы, эластазы) животных и человека. Было показано, что Bacillus sp. 1839 продуцирует тетродотоксин, который является сильнейшим ядом нервнопаралитического действия и может применяться в медицине в качестве анестетика и антиаритмика (Nieto F.R., Cobos E.J., Tejada М.., С., R., С.М. Tetrodotoxin (ТТХ) as a Therapeutic Agent for Pain. Marine Drugs. 2012; 10(2):281-305; C.O., Bredeloux P., Findlay I., Maupoil V. A TTX-Sensitive Resting Na(+) Permeability Contributes to the Catecholaminergic Automatic Activity in Rat Pulmonary Vein. J Cardiovasc Electrophysiol. 2014. Oct. 27). Установлено, что накопление токсина у Bacillus sp. 1839 происходит главным образом в эндоспорах и свободных спорах, т.е. количество токсина напрямую зависит от бактериальной биомассы (Magarlamov T.Yu., Beleneva I.A., Chernyshev A.V., Kukhlevsky A.D. Tetrodotoxin-producing Bacillus sp. from the ribbon worm (Nemertea) Cephalothrix simula (Iwata, 1952) // Toxicon. 2014. Vol. 85. P. 46-51).

Использование предлагаемого гипертонического фосфатного буферного раствора стимулирует спорообразование в короткий промежуток времени, что значительно ускоряет процесс получения спор и одновременно позволяет дополнительно отмыть их от питательной среды, что не только повышает чистоту продукта, но и сокращает длительность процесса получения целевого продукта. Для достижения поставленной цели целесообразно использовать гипертонический фосфатный буфер: хлорид калия 0,2 г/л, гидрофосфат натрия 3,3 г/л, дигидрофосфат калия 0,166 г/л, хлорид натрия от 46,334 до 56,334 г/л. Приготовленный фосфатный буфер имеет рН 7,8, что соответствует оптимуму роста для морских бактерий штамма Bacillus sp. 1839.

Время выдерживания (инкубирования) бактерий в гипертоническом фосфатном буфере в течение 15-60 мин также способствует достижению заявленного технического результата, вследствие чего происходит значительное сокращение процесса получения целевого продукта. Уменьшение количества времени выдерживания менее 15 мин в буферном растворе не вызывает образования спор, а увеличение времени более 60 мин приводит к гибели вегетативных форм бактерий без перехода в споровую форму.

Для очистки от оставшихся вегетативных клеток дополнительно проводят термическую обработку одним из известных методов, в частности полученный осадок спор нагревают не менее 10 мин при 70-90°С на водяной бане, добавляют буферный раствор, центрифугируют и удаляют надосадочную жидкость, содержащую остатки вегетативных клеток.

Целесообразно, как для отделения биомассы бактерий от жидкой среды, так и для осаждения спор, центрифугирование вести не более 5 мин при 1000-1500 об/мин, это позволяет не только получить качественный споровый материал, но и снизить трудо- и энергозатраты.

Способ осуществляют следующим образом.

Выбор среды для культивирования не принципиален и зависит от доступности ингредиентов. Среды стерилизуются автоклавированием.

Культуру бактерий штамма Bacillus sp. 1839 брали из Коллекции культур морских гетеротрофных бактерий ИБМ ДВО РАН.

Для приготовления фосфатного буфера используют бидистиллированную или дистиллированную воду.

Пример 1

С соблюдением правил асептики производят засев жидкой питательной среды. Для этого вносят культуру бактерий Bacillus sp. 1839 в количестве 0,1% от объема засеваемой среды в жидкую питательную среду Йошимицу-Кимура (Youschimizu and Kimura, 1976) следующего состава: пептон (5,0 г), дрожжевой экстракт (2,5 г), глюкоза (1,0 г), К₂НРО₄ (0,2 г), MgSO₄·7H₂O (0,1 г), дистиллированная вода (500 мл), морская вода (500 мл), рН среды 7,8. Культивирование проводят при 21°С в течение 7 суток. Полученную биомассу бактерий отделяют от жидкой питательной среды центрифугированием: при 1500 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают и к чистому бактериальному осадку добавляют гипертонический фосфатный буферный раствор, приготовленный на бидистиллированной воде, следующего состава: хлорид калия 0,2 г/л, гидрофосфат натрия 3,3 г/л, дигидрофосфат калия 0,166 г/л, хлорид натрия 50 г/л, и выдерживают бактерии в течение 30 мин при комнатной температуре. Наличие спор определяют в мазках культуры, окрашенных по методу Пешкова. Для этих целей готовят мазок, высушивают. На стекло наносят щелочной раствор метиленового синего (1% NaOH) и нагревают в пламени горелки в течение 15 с. Препараты промывают дистиллированной водой и докрашивают 0,5% раствором нейтрального красного (Sigma, США). Анализ препаратов производят на световом микроскопе. При указанном способе культивирования переход вегетативных клеток в споры составляет 95%. Полученная споровая культура не содержит компонентов питательной среды.

Для очистки от оставшихся вегетативных клеток проводят термическую обработку следующим образом.

Полученный осадок спор нагревают 10 мин при 80°С на водяной бане, добавляют буферный раствор (хлорид калия 0,2 г/л, гидрофосфат натрия 3,3 г/л, дигидрофосфат калия 0,166 г/л, хлорид натрия 50 г/л), центрифугируют 1500 об/мин в течение 5 мин и удаляют надосадочную жидкость, содержащую остатки вегетативных клеток.

Пример 2

С соблюдением правил асептики производят засев жидкой питательной среды. Для этого вносят 0,1% культуры бактерий Bacillus sp. 1839 от объема среды в жидкую питательную среду Йошимицу-Кимура (Youschimizu and Kimura, 1976) следующего состава: пептон (5,0 г), дрожжевой экстракт (2,5 г), глюкоза (1,0 г), К₂НРО₄ (0,2 г), MgSO₄·7H₂O (0,1 г), дистиллированная вода (500 мл), морская вода (500 мл), рН среды 7,8. Культивирование проводят при 22°С в течение 5 суток. Полученную биомассу бактерий отделяют от жидкой питательной среды центрифугированием: при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают и к чистому бактериальному осадку добавляют гипертонический фосфатный буферный раствор, приготовленный на бидистиллированной воде, следующего состава: хлорид калия 0,2 г/л, гидрофосфат натрия 3,3 г/л, дигидрофосфат калия 0,166 г/л, хлорид натрия 46,334 г/л, и выдерживают бактерии в течение 60 мин при комнатной температуре. Наличие спор определяют в мазках культуры, окрашенных по методу Пешкова. Для этих целей готовят мазок, высушивают. На стекло наносят раствор метиленового синего с 1% NaOH и нагревают в пламени горелки в течение 15 с. Препараты промывают дистиллированной водой и докрашивают 0,5% раствором нейтрального красного (Sigma, США). Анализ препаратов производят на световом микроскопе. При указанном способе культивирования переход вегетативных клеток в споры составляет 80%. Полученная споровая культура не содержит компонентов питательной среды.

Для очистки от оставшихся вегетативных клеток проводят термическую обработку следующим образом.

Полученный осадок нагревают 10 мин при 80°С на водяной бане, добавляют буферный раствор (хлорид калия 0,2 г/л, гидрофосфат натрия 3,3 г/л, дигидрофосфат калия 0,166 г/л, хлорид натрия 50 г/л), центрифугируют 1500 об/мин в течение 5 мин и удаляют надосадочную жидкость, содержащую остатки вегетативных клеток.

Для очистки от оставшихся вегетативных клеток проводят термическую обработку следующим образом.

Полученный осадок нагревают 10 мин при 90°С на водяной бане, добавляют буферный раствор (хлорид калия 0,2 г/л, гидрофосфат натрия 3,3 г/л, дигидрофосфат калия 0,166 г/л, хлорид натрия 46,334 г/л), центрифугируют 1000 об/мин в течение 5 мин и удаляют надосадочную жидкость, содержащую остатки вегетативных клеток.

Пример 3

С соблюдением правил асептики вносят 0,1% культуры бактерий Bacillus sp. 1839, полученной в результате одного из предыдущих культивирований, в колбы с питательной средой: мясопептонный бульон (0,5% водный раствор мясного экстракта, 1,0% пептона, 0,5% натрия хлорида, рН среды 7,6). Бактерии выращивают при 23°С в течение 4 суток. Полученную биомассу бактерий отделяют от жидкой питательной среды центрифугированием: при 1200 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают и к чистому бактериальному осадку добавляют гипертонический фосфатный буферный раствор, приготовленный на дистиллированной воде, следующего состава: хлорид калия 0,2 г/л, гидрофосфат натрия 3,3 г/л, дигидрофосфат калия 0,166 г/л, хлорид натрия 56,334 г/л, и выдерживают бактерии в течение 15 мин при комнатной температуре. Наличие спор определяют в мазках культуры, окрашенных по методу Пешкова. Для этих целей готовят мазок, высушивают. На стекло наносят раствор метиленового синего с 1,0% NaOH и нагревают в пламени горелки в течение 15 с. Препараты промывают дистиллированной водой и докрашивают 0,5% раствором нейтрального красного (Sigma, США). Анализ препаратов производят на световом микроскопе. При указанном способе культивирования переход вегетативных клеток в споры составляет 82%. Полученная споровая культура не содержит компонентов питательной среды.

Для очистки от оставшихся вегетативных клеток проводят термическую обработку следующим образом.

Полученный осадок нагревают 10 мин при 70°С на водяной бане, добавляют буферный раствор (хлорид калия 0,2 г/л, гидрофосфат натрия 3,3 г/л, дигидрофосфат калия 0,166 г/л, хлорид натрия 56,334 г/л), центрифугируют 1200 об/мин в течение 5 мин и удаляют надосадочную жидкость, содержащую остатки вегетативных клеток.

Пример 4 по известному способу (Baril Е. et al., 2011)

Засев жидкой питательной среды 0,1 мл бактерий Bacillus sp. 1839 в 100 мл жидкой питательной среды и культивируют вегетативные клетки бактерий в течение 6 ч при 30°С, затем бактерии осаждают (6000×g, 10 мин, 12°С) и переносят в фосфатный буфер с добавлением минеральных солей следующего состава: 4,5 г/л K₂HPO₄·3H₂O; 1,8 г/л безводного KH₂PO₄, с добавлением 8,0 мг/л CaCl₂·2H₂O, 1,5 мг/л MnSO₄·H₂O; рН 7,2. Инкубируют 4 дня при постоянном перемешивании до образования спор. Споры осаждают центрифугированием для отделения готового продукта от минерального буфера (6000 g, 10 мин, 12°С). На 4-е сутки культивирования спор в минеральном буфере культура представлена преимущественно вегетативными формами, много клеток с разрушенной клеточной стенкой, а концентрация спор не превышает 5%.

Для нейтрализации жизнедеятельности вегетативных клеток проводят термическую обработку: осадок нагревают 10 мин при 70°С на водяной бане.

Из результатов эксперимента примера 4, проведенного по условиям известного способа получения спорового материала, следует, что эти условия не подходят для штамма Bacillus sp. 1839, поскольку практически не обеспечивают получение спор.

В то же время из примеров 1-3 видно, что заявленное изобретение обеспечивает переход в споры до 95% популяции уже через полчаса после инкубации в предлагаемом гипертоническом фосфатном буфере, то есть значительно снижает длительность процесса образования спор. Способ прост в исполнении, имеет простую технологию и позволяет получать споровую культуру в любой бактериологической или ветеринарной лаборатории при минимальных производственных затратах. Предлагаемый способ не требует многокомпонентных питательных сред с дефицитными субстратами.

Заявленный способ получения спор по сравнению с известным способом менее длителен и подходит для штамма Bacillus sp. 1839, отделение бактерий от жидкой питательной среды в отличие от прототипа не требует использования жестких условий центрифугирования.

Исследование выполнено при поддержке ДВФУ, проект №14-08-06-19_и.