СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ОБОСТРЕНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА СКЕЛЕТ ЭРИТРОЦИТОВ

1. Цель изобретения - разработать способ оценки влияния цитомегаловирусной инфекции на белок полосы-3 скелета эритроцита при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа, позволяющего оценить влияние цитомегаловирусной инфекции на содержание белка полосы-3 скелета эритроцита при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации приводящее к снижению числа нормальных эритроцитов и увеличению дегенеративных форм в периферической крови, что может вызвать угрозу формирования анемии.

3. Этот белок называется полосой-3, поскольку занимает при гель-электрофорезе в присутствии додецилсульфата третье порядковое место относительно других белков. Полоса-3 является трансмембранным белком и имеет глобулярную конформацию, а его полипептидная цепь длиной 930 аминокислотных остатков пересекает бислой мембраны эритроцита, по крайней мере, в 10 раз [1, 2, 3, 6]. Каждый эритроцит содержит около 10⁶ молекул белка полосы-3, которые образуют димеры и тетрамеры [1, 9]. Основная функция эритроцитов заключается в переносе O₂ к тканям и забирает от них CO₂. Белок полосы-3 принимает участие в этом обмене. Находясь в легких, эритроциты избавляются от CO₂ путем замены ионов HCO₃ ^- на Cl^-. В мембране как раз эту функцию выполняет белок полосы-3 [2, 4]. Он осуществляет пассивный транспорт полярных молекул через неполярный бислой мембраны. Поэтому полоса-3 обеспечивает трансмембранный гидрофильный проход, по которому ионы Cl^- и HCO^- ₃ переносятся без контакта с гидрофильным окружением липидного бислоя [5, 8].

4. Новая техническая задача

Разрабатывается способ, позволяющий путем гель-электрофореза установить количественное содержание в мембране эритроцита белка полосы-3, по которому судят о состоянии целостности скелета эритроцита и выполнения транспортной функции в процессе газообмена.

5. В доступной литературе имеются сведения [7, 8] об участии белка полосы-3 в переносе Na⁺, K⁺, HCO₃ ^-, Cl^- в организме здорового человека, а также при испытаниях in vitro. В отличие от вышеприведенных данных наши исследования отмечают:

1. Белки полосы-3 помимо транспортной функции участвуют и в связи с белком анкирином, укрепляя скелет эритроцита.

2. Под влиянием цитомегаловирусной инфекции количество белка полосы-3 снижается, что оказывает влияние на устойчивость скелета эритроцита.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследовано 25 беременных в возрасте 18-27 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией (ХЦМВИ) в стадии обострения на 25-26 неделях гестации и 10 беременных, не болевших на всем протяжении беременности. Диагноз обострение ХЦМВИ устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM к ЦМВ или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65%, а также наличия ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекс авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (США) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.2. Исследование белкового состава мембран эритроцитов проводили с помощью вертикального одномерного диск-электрофореза в градиентном (7,5-10%) полиакриламидном геле в присутствие 0,1% раствора додецилсульфата натрия. Полипептидные зоны окрашивали в 0,1% растворе R-250, 50% растворе спирта и 7% растворе уксусной кислоты. Идентификацию электрофореграмм проводили при длине волны 590-600 нм с помощью установки «BioDocAnalize» (Германия).

6.3. Морфология эритроцитов, окрашенных по Романовскому-Гимза, изучалась на цитофотометрической установке «Mekos» (Москва).

6.4. Морфофункциональное состояние эритроцитов периферической крови изучалось с помощью цитофотометрической установки «Pixera» (США) по программе «BioVision» (США).

7. Все расчеты производились с использованием программного обеспечения «Statistica 6.0». Проверку нормальности распределения проводили по критерию Колмогорова-Смирнова. Проверку гипотезы по статистической значимости различий двух выборок проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Показатели считали значимыми при p<0,05.

8. Полученные данные

В процессе исследования получены следующие результаты. При обострении ХЦМВИ на третьем триместре гестации до титра антител IgG к ЦМВ до 1:1600 отмечалось снижение в мембранах эритроцитов методом гель-электрофореза содержание белка полосы-3 до 14,50±0,44% (контроль - 18,34±0,19%; p<0,05). При этом отмечались значительные изменения в структуре эритроцитов периферической крови. У беременных, перенесших обострение ЦМВИ до титра антител 1:1600 во время родов в периферической крови отмечалось увеличение количества дегенеративных форм до 12,70±1,1% (контроль - 4,60±0,08%). Исследования мазков крови выполнялись на аппарате «Mekos» и установке «Pixera» по программе «BioVision». При таких изменениях морфологической структуры эритроцитов, вызванной обострением ЦМВИ, создается угроза формирования гемической анемии у беременных на третьем триместре гестации.

Литература

1. Anong W., Franco T., Chu Н., Weis Т. Adducin forms a bridge between the erythrocytes membrane and its cytoskeleton and regulates membrane cohesion // Blood. 2009. Vol. 114. P. 1904-1912.

2. Enderward V., Cartron J., Ripoche P., Gros G. RhAG protein of the rgesus complex is ω₂ channel in the human red cell membrane // FASEB Jour. 2008. Vol. 22. P. 64-73.

3. Franke R.P., Scharnweber Т., Fuhrmann R. Mrowietz C. Effect of radiographic contrast media (lodixanol, lopromide) on the spectrin / actin-network of the membranous sytoskeleton of erythrocytes // Clin Hemorheol. Microcire. 2013. Vol. 54. P. 273-285.

4. Hoffman J.E., Dodson A., Proverbio F. On the functional use of the membrane compartmentalized pool of ATPby the Na⁺ and Ca⁺⁺ pumps in human red blood cell ghosts // J. Gen. Physion. 2009. Vol. 134. P. 351-361.

5. Sowah D., Casey J. An intramoleular transport metabolon: fusion of carbonic anhydrase II to the COOH terminus of the Cl^-/HCO₃ ^- exchanger, AE1 // Amer. J. Physiol. Cell. Physiol. 2011. Vol. 301. P. 336-346.

6. Stefanovic M., Makham N., Parry E., Garrett I. An 11-amine acid beta-hairpin loop in the cytoplasmic domain of band 3 is responsible for ankyrin binding in mouse erythrocytes // Proc. Nat. Acad. USA. 2007. Vol. 104. P. 13972-13977.

7. Telen M., Kaufman R. The mature erythrocyte // Clinical Hematology. 2004. P. 217-247.

8. Tiffert Т., Lew V.L. Elevated intracellular Ca⁺⁺ reveals a functional membrane nucleotide pool in intact human red blood cells // J. Gen. Physiol. 2011. Vol. 138. P. 381-391.

9. Wang D., Sarabia V.E., Reithmeier R.A., Kuhlbrandt W. Thee-dimensional map of the dimeric membrane domain of human ery anion exchanger, Band 3 // EMBO Jour. 1994. Vol. 13, №14. P. 3230-3235.