СПОСОБ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ АНДРОСТЕНДИОНА В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ

1. Цель изобретения - оценить характер влияния цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации на содержание андростендиона в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, приводящей к нарушению развития и созревания органов плода в период гестации.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке гистохимического способа определения снижения содержания андростендиона в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности.

3. Раскрытие изобретения

Во время гестации большое количество эстрогенов продуцируется из холестерина через образование ряда андрогенов - дегидроэпиандростерона и андростендиона. В плаценте основное количество андростендиона превращается в эстрон и далее в 17β-эстрадиол [7]. Поэтому уменьшение количества андростендиона приведет к нарушению формирования эстрона и эстрадиола в фетоплацентарной системе.

В третьем триместре беременности эстрогены необходимы для функционального созревания плаценты и плода. Они влияют на выработку других стероидных и белковых гормонов, контролируют экспрессию липопротеидов низкой плотности, стимулируют трансплацентарное окисление материнского кортизола, что приводит к созреванию у плода оси гипоталамус - гипофиз - надпочечник в конце беременности [5]. Эстрогены регулируют развитие легких, почек, печени, костной ткани и яичника плода [2, 5]. Снижение активности формирования эстрогеновых гормонов окажет влияние на развитие и созревание органов плода.

4. Новая техническая задача

Определить уровень содержания андростендиона в синцитиотрофобласте ворсинок при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации с целью оценки характера состояния фетоплацентарного барьера во время беременности, от чего зависит нормальное развитие и созревание органов плода.

5. В доступной литературе имеются упоминания об исследовании обмена андростендиона радиометрическим методом в плаценте при гипертензии у беременных [4], при токсемии беременности [6], при экспериментальной стрептококковой инфекции радиоиммунологическим методом [3]. Недостатком вышеупомянутых методов является необходимость дорогостоящей регистрирующей аппаратуры и реактивов: радиоактивных веществ, имеющих короткий срок хранения; соблюдение усиленных мер по технике безопасности, связанных с радиационным риском для персонала и окружающей среды. Биохимические методы не дают представления о месте локализации вещества.

В отличие от вышеприведенных прототипов в данной работе имеются существенные отличия: 1) анализ содержания андростендиона проводится с помощью гистохимической реакции, в качестве субстрата для которой используется андростендион; 2) изменения содержания андростендиона происходят под влиянием обострения цитомегаловирусной инфекции во время беременности. Метод прост в исполнении, не требует дорогостоящих реактивов, обладает хорошей разрешающей способностью и может быть рекомендован в проведении научно-исследовательских работ и лабораторной диагностики.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследованы 38 беременных женщин 18-25 лет с обострением хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, контрольную группу составили 30 беременных женщин с хронической цитомегаловирусной инфекцией в латентной стадии. У беременных женщин симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение хронической цитомегаловирусной инфекции) устанавливается по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), JgM или увеличение титра антител JgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводят с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

6.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляют методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ДНК ЦМВ выявляют методами ПНР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.3. Активность андростендиондегидрогеназы гистохимически определяют на криостатных срезах свежезамороженной нефиксированной ткани плаценты следующим методом. Метод основан на восстановлении соли тетразолия в формазан электронами, акцептируемыми от субстрата через кофермент НАДФ [1]. Субстратом служит 2 мМ раствор андростендиона «Sigma» (США). Для его приготовления 6 мг 4-андростен-3,17-диона растворяют в 10 мл Ν,Ν-диметилформамида Инкубационный раствор готовится на основе 0,1 M фосфатного буфера рН 7,2-7,4 с добавлением нитросинего тетразолия фирмы «ICN Biomedicals)) (США) в конечной концентрации 5 ммоль, НАДФ⁺ фирмы «Applichem» (Германия) - 1 ммоль.

Состав инкубационной среды:

0,1 M фосфатный буфер рН 7,2-7,4 - 1 мл;

нитросиний тетразолий - 1 мг;

НАДФ⁺ - 1 мг;

2 мМ раствор андростендиона - 0,1 мл.

6.4. В 1 мл инкубационного раствора помещают свежеприготовленные срезы ткани. Инкубацию проводят при 37°С в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывают дистиллированной водой, фиксируют в 10%-ном нейтральном формалине при комнатной температуре, вновь промывают дистиллированной водой, подсушивают и заключают в глицерин-желатин. Контрольные срезы инкубировали в среде, содержащей вместо раствора андростендиона адекватное количество фосфатного буфера. Полученные гистологические препараты изучают цитофотометрическим компьютерным методом с помощью программы Scion (США) на цифровом микроскопе MEIJI (Япония).

6.5. Статистический анализ и обработка данных проводится с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений M±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n₁+n₂-2. Для определения достоверности различий используется непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимаются во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.

7. Полученные данные

В процессе исследования получены следующие результаты. На гистохимических препаратах плаценты беременных, перенесших обострение хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, при регистрации роста титра антител класса G к цитомегаловирусу до 1:1600 отмечается снижение активности реакции, отражающей содержание андростендиона до 32,1±2,88 усл. ед. (фигура 1); (контроль - 54,2±4,31 усл. ед.) (фигура 2), что создает угрозу на развитие и созревание органов плода в период гестации.

Литература

1. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы: пер. с англ. М.: Мир, 1982. 272 с.

2. Albrecht E.D., Pepe G.J. Central integrative role of oestrogen in modulating the communication between the placenta and fetus that results in primate fetal-placental development // Placenta. 1999. Vol.20, Is. 2. P. 129-139.

3. Gravett M.G., Haluska G.J., Cook M.J., Novy M.J. Fetal and maternal endocrine responses to experimental intrauterine infection in rhesus monkeys // Am. J. Obstet. Gynecol. 1996. Vol. 174, №6. P. 1725-1731.

4. Flannel M.E., Martin J.D., Michael C.A., Hahnel R. Metabolism of androstenedione by placental microsomes in pregnancy hypertension // Clin. Chim. Acta. 1989. Vol. 81, №1. P. 103-108.

5. Pepe G.J., Albrecht E.D. Central integrative role of oestrogen in the regulation of placental steroidogenic maturation and the development of the fetal pituitary-adrenocortical axis in the baboon // Hum. Reprod. Update. 1998. Vol.4, №4. P. 406-419.

6. Rahman S.A., Hingorani V., Laumas K. R. Biosynthesis of oestrogens and their inter-conversion in human placentae from normal and toxaemic pregnancies // Clin. Endocrinol. (Oxf). 1975. Vol.4, №4. P.333-341.

7. Strauss J.F., Martinez F., Kiriakidou M. Placental steroid hormone synthesis: unique features and unanswered questions // Biol. Reprod. 1996 Vol.54, №2. P. 303-311.