СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ α-КЕТОГЛУТАРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ВОРСИНОК ПЛАЦЕНТЫ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ

1. Цель изобретения - разработать способ оценки активности α-кетоглутуратдегидрогеназы в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, отражающий характер активности энергетических процессов в фетоплацентарном барьере при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке гистохимического способа определения активности α-кетоглутаратдегидрогеназы в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности.

3. Раскрытие изобретения

Альфа-кетоглутарат образуется при дезаминировании аминокислот и поступает в цикл Кребса, тем самым связывая углеводный и белковый обмен. В цикле Кребса α-кетоглутарат посредством α-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса подвергается окислительному декарбоксилированию [7]. Альфа-кетоглутаратдегидрогеназа генерирует восстановительные эквиваленты - НАДН⁺, поставляющие электроны в дыхательную цепь. Кроме этого, в результате реакции образуется сукцинил-КоА, содержащий в своем составе высокоэнергетическую связь, соединяющую ацильные остатки с КоА [3]. Снижение активности α-кетоглутаратдегидрогеназы свидетельствует об угнетении поставки НАДН⁺ в электронтранспортную цепь митохондрий и, следовательно, о нарушении процессов энергообмена в синцитиотрофобласте, от которого зависит нормальное развитие плода.

4. Новая техническая задача

Определить уровень активности α-кетоглутаратдегидрогеназы при обострении цитомегаловирусной инфекции у беременных на третьем триместре гестации с целью оценить характер состояния энергетического обмена в фетоплацентарном барьере в период гестации.

5. В доступной литературе известен цитобиохимический способ выявления митохондриальных функций и дисфункций [2, 4] по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы на лимфоцитах в мазке крови, отличающийся сложностью выполнения и расчетов. Кроме этого, активность α-кетоглутаратдегидрогеназы в головном мозге при нейродегенеративных заболеваниях, в основном, при болезни Альцгеймера [6, 8], изучается иммуногистохимическим методом, недостатком которого является необходимость дорогостоящих реактивов, оборудования и длительного времени исполнения. Существует также биохимический метод выявления α-кетоглутаратдегидрогеназы в сердце, не дающий представления о месте локализации фермента [5].

В отличие от вышеперечисленных прототипов в данной работе имеются существенные отличия: 1. Объектом исследования является плацента. 2. Изменения активности α-кетоглутаратдегидрогеназы происходят под влиянием обострения цитомегаловирусной инфекции во время беременности. 3. Использование данного метода позволяет судить о состоянии энергетического обмена в фетоплацентарном барьере, влияющего на развитие плода. Метод прост в исполнении, не требует дорогостоящих реактивов, обладает хорошей разрешающей способностью и может быть рекомендован в проведении научно-исследовательских работ и для лабораторной диагностики.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследованы 36 беременных женщин 18-25 лет с реактивацией хронической цитомегаловирусной инфекции во время гестации, контрольную группу составили 22 беременных с хронической цитомегаловирусной инфекцией в латентной стадии. Клинический диагноз (обострение хронической цитомегаловирусной инфекции) устанавливался по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), JgM или увеличение титра антител JgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводили с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

6.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляли методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ДНК ЦМВ выявляли методами ПНР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.3. Активность α-кетоглутаратдегидрогеназы гистохимически определяли на криостатных срезах свежезамороженной нефиксированной ткани плаценты следующим методом. Метод основан на восстановлении соли тетразолия в формазан электронами, акцептируемыми от субстрата через кофермент НАД [1]. Субстратом служил 0,1 М раствор натриевой соли α-кетоглутаровой кислоты фирмы «Sigma» (США). Инкубационный раствор готовился на основе 0,1М фосфатного буфера рН 7,2-7,4 с добавлением нитросинего тетразолия фирмы «ICN Biomedicals)) (США) в конечной концентрации 5 мМоль, НАД⁺ фирмы «Applichem» (Германия) - 1 мМоль.

Состав инкубационной среды:

- 0,1 М фосфатный буфер рН 7,2-7,4 - 1 мл;

- нитросиний тетразолий - 1 мг;

- НАД⁺ - 1 мг;

- натриевая соль α-кетоглутаровой кислоты - 16,8 мг.

6.4. В 1 мл инкубационного раствора помещают свежеприготовленные срезы ткани плаценты человека. Инкубацию проводят при 37°C в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывают дистиллированной водой, фиксируют в 10%-ном нейтральном формалине, вновь промывают дистиллированной водой, подсушивают и заключают в глицерин-желатин. Контрольные срезы инкубируют в среде, содержащей вместо раствора α-кетоглутарата натрия адекватное количество фосфатного буфера. Полученные гистологические препараты изучают цитофотометрическим компьютерным методом с помощью программы Scion (США) на цифровом микроскопе MEIJI (Япония).

6.5. Статистический анализ и обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений M±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n₁+n₂-2. Для определения достоверности различий использовался непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимались во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений, непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.

7. Полученные данные

В процессе исследования получены следующие результаты. Гистохимическая реакция выявления активности α-кетоглутаратдегидрогеназы является достаточно специфичной. На гистохимических препаратах плацент женщин, перенесших обострение хронической цитомегаловирусной инфекции с регистрацией роста титра антител класса G к цитомегаловирусу до 1:1600 в третьем триместре гестации, отмечается снижение активности α-кетоглутаратдегидрогеназы до 34,6±2,78 усл. ед. (контроль - 51,4±1,59 усл. ед.) (фигура 1, 2).

Таким образом, снижение активности α-кетоглутаратдегидрогеназы в синцитиотрофобласте плаценты при нарастании титра антител класса G к цитомегаловирусу до 1:1600 указывает на снижение энергетического обмена в плаценте, что создает угрозу нарушению развития плода.

На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на α-кетоглутаратдегидрогеназу в плаценте женщины, перенесшей на третьем триместре гестации обострение цитомегаловирусной инфекции с титром антител класса G 1:1600. Отмечается снижение активности гистохимической реакции до 34,6±2,78 усл. ед. Увеличение - 10×100.

На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на α-кетоглутаратдегидрогеназу в плаценте женщины контрольной группы (не болевшей на всем протяжении гестации). Интенсивность гистохимической реакции - 51,4±1,59 усл. ед. Увеличение - 10×100.

Литература

1. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы: пер. с англ. - М.: Мир, 1982. 272 с.

2. Хундерякова Н.В., Захарченко М.В., Захарченко А.В., Романова О.И., Кондрашова М.Н. Новый микроскопический высокочувствительный метод выявления митохондриальных функций и дисфункций в организме животных и человека по исследованию митохондрий лимфоцитов в мазке крови // Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных: материалы III Международной интернет-конференции. Казань, 3-6 апреля 2012. Казань: "Казанский университет". 2012. С.135-148.

3. Gibson G.E., Blass J.P., Beal M.F., Bunik V. The alpha-ketoglutaratedehydrogenase complex: a mediator between mitochondria and oxidative stress in neurodegeneration // Mol. Neurobiol. 2005. Vol. 31, №1-3. P. 43-63.

4. Kondrashova M.N., Zakharchenko M.V., Khunderyakova N.V. Preservation of the in vivo state of mitochondrial network for ex vivo physiological study of mitochondria // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2009. Vol. 41. P. 2036-2051.

5. Markiewicz J., Strumiło S.A. Some regulatory properties of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex from European bison heart // Acta Biochim. Pol. 1995. Vol. 42, №3. P. 339-346.

6. Mizuno Y., Matuda S., Yoshino H., Mori H., Hattori N., Ikebe S. An immunohistochemical study on alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex in Parkinson′s disease // Ann. Neurol. 1994. Vol. 35, №2. P. 204-210.

7. Sheu K.F., Blass J.P. The alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1999. Vol. 893. P. 61-78.

8. Sheu K.F., Calingasan N.Y., Lindsay J.G., Gibson G.E. Immunochemical characterization of the deficiency of the alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex in thiamine-deflcient rat brain // J. Neurochem. 1998. Vol. 70, №3. P. 1143-1150.