Результат интеллектуальной деятельности: ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО КЕРАТОКОНЪЮНКТИВИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА ОСНОВЕ АНТИГЕНОВ БАКТЕРИЙ Moraxella bovis И Moraxella bovoculi

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к производству и применению биологического препарата против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота. Вакцина предназначена для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивит крупного рогатого скота, вызываемого бактериями Moraxella bovis и Moraxella bovoculi.

Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота (ИКК) - острое контагиозное заболевание, характеризующееся слезотечением, гиперемией сосудов конъюнктивы, светобоязнью, серозно-гнойным истечением, помутнением и изъязвлением роговицы, деформацией глазного яблока в виде кератоглобуса или кератоконуса, частичной или полной потерей зрения пораженного глаза животного. Болезнь распространена во всех странах мира и наносит скотоводческим хозяйствам значительный экономический ущерб вследствие снижения удоев молока до 50%, прироста массы тела на 31-37%, падежа, а также затрат на проведение ветеринарно-санитарных и лечебно-профилактических мероприятий. Нами установлено, что заболеваемость телят 2-6-месячного возраста в отдельных хозяйствах достигает до 85%, среди откормочного поголовья - 22% и среди дойного стада - в пределах 8-10%.

Заболевание вызывается гемолитическими штаммами бактерий Moraxella bovis (Гаффаров Х.З., Валебная Л.В., Спиридонов Г.Н. Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота в регионе Среднего Поволжья и Предуралья / Матер. междунар. науч.-практ. конф.: Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. - Воронеж. - 2002. - С. 188-191; Карайченцев В.Н., Дунаев Г.В., Русинов А.Ф., Бабенко О.В. Изоляция Moraxella bovis от молодняка крупного рогатого скота при инфекционном кератоконъюнктивите / Ветеринария. - 1992. - №2. - С. 26-27; Русинов А.Ф. Инфекционный кератоконъюнктивит у крупного рогатого скота / Информ. бюлл. Укр. акад. аграр. наук. Ин-т эксперим. клинич. вет. медицины, 1995; Спиридонов Г.Н. Инфекционный кератоконьюнктивит крупного рогатого скота // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных. - Труды межд. научн.-производ. конф., посвященной 50-летию ВНИИВВиМ. - том 2. - Покров. - 2008. - С. 195-197. Arora А.К. Studies on Moraxella bovis isolated from cattle affected with or convalescing from infectious bovine keratoconjunctivitis / Vet. Arhiv. - 1989. - V. 50. - №l. - P. 17-23).

В последние годы установлено, что инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота может быть вызван другими представителями рода Moraxella, в частности бактериями Moraxella bovoculi (Angelos J.A., Spinks P.Q., Ball L.M., George L.W. Moraxella bovoculi sp.nov., isolated from calves with infectious bovine keratoconjunctivitis // Int J Syst Evol Microbiol - 2007 Apr; 57 (Pt 4):789-95; Galvão K.N., Angelos J.A., Ulcerative blepharitis and conjunctivitis in adult dairy cows and association with Moraxella bovoculi // Can Vet J. - 2010 Apr; 51(4):400-2; Angelos J.A., Lane V.M., Ball L.M., Hess J.F. Recombinant Moraxella bovoculi cytotoxin-ISCOM matrix adjuvanted vaccine to prevent naturally occurring infectious bovine keratoconjunctivitis. / Vet Res Commun. 2010 Mar; 34 (3); Angelos J.A., Ball L.M, Differentiation of Moraxella bovoculi sp. nov. from other coccoid moraxellae by the use of polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis of amplified DNA // J Vet Diagn Invest - 2007 Sep; 19 (5):532-(4).

Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота, вызванный бактериями Moraxella bovoculi, мы наблюдали в хозяйствах Республики Татарстан (совхоз-техникум Чистопольского; ООО «Среднее Девятово», ООО «Хаерби» Лаишевского и СХПК «Енали» Апастовского районов), Республики Башкортостан (СПК-колхоз имени Калинина Дюртюлинского района), Ленинградской области (ООО «Яровое» Приозерского района), Челябинской области (ООО «Агрофирма «Калининское» Брединского района).

В настоящее время основным методом борьбы с инфекционным кератоконъюнктивитом крупного рогатого скота является специфическая ее профилактика с использованием различных видов вакцинных препаратов (Hughes D. et. al. Experimenally induced Bovine Infectious Keratoconjunctivitis: Effectivcnes of Intramuscular Vaccination with Viable Moraxella bovis Culture. // Am, J. Vet. Res., 1971, 32 №6 - p.879-886; Pugh G.W. et al. Infections bovine keratoconjunctivitis in cattle vaccinated and medicated against Moraxella bovis befare parturition. // Am. J. Vet. Res., 1982, 43 №2 - p.320-325; Gwin R. Medicament and method for prodicing immunity the infectious bovine keratoconjunctivitis.// Патент США №4539.201. от 3 сентября 1985). В Российской Федерации разработана и выпускается «Ассоциированная вакцина для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпес-вируса типа 1» (патент RU №2264227, А61К 39/295, С12N 1/20, 7/00, А61Ρ 31/00, опуб. 20.11.05 г.). Недостатком данной вакцины является неполный ее антигенный состав, а именно отсутствие в ней антигена бактерий Moraxella bovoculi, одного из наиболее часто встречающихся возбудителей инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, что делает ее малоэффективной в хозяйствах, где превалирует этот возбудитель.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении вакцины, обладающей повышенной антигенной и иммуногенной активностью, расширении спектра действия и защитного эффекта вакцины.

Это достигается тем, что вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi в качестве антигенов содержит инактивированные суспензии клеток штаммов бактерий Moraxella boyis «Г97-ВНИВИ» с концентрацией 100-120 млрд. м.к. на 1 см³ и Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП» с концентрацией 100-120 млрд. м.к. на 1 см³, взятые в равных соотношениях на физиологическом растворе, в качестве адъюванта - 6%-ный гель гидроокиси алюминия, в качестве инактиватора - формалин при следующем соотношении компонентов на 1 л. вакцины: суспензия клеток штамма бактерий Moraxella bovis «Г97-ВНИВИ» с концентрацией 100-120 млрд. м.к. в 1 см³, см³ - 90,0-100,0; суспензия клеток штамма бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП» с концентрацией 100-120 млрд. м.к. в 1 см³, см³ - 90,0-100,0; гель гидроокиси алюминия, 6%-ный, см³ - 90,0-100,0; формалин, см³ - 4,0-5,0 и физиологический раствор, л. - до 1.

Для изготовления вакцины ассоциированной для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi используют запатентованные нами штаммы бактерий Moraxella bovis «Г97- ВНИВИ» (Патент РФ №2145353; опубл. 10.02.2000 г.) и Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП» (Патент РФ №2521651; опубл. 10.07.2014 г.), выделенные от больных инфекционным кератоконъюнктивитом телят.

Штамм бактерий Moraxella bovis «Г97-ВНИВИ» характеризуется следующими свойствами: это короткие толстые палочки длиной 1,5-2,0 и в диаметре 0,5-1,0 мкм с округленными концами, расположенные парами или в виде коротких цепочек, спор не образуют, неподвижные, окрашиваются грамотрицательно. На кровяном ΜΠΑ при рН 7,2-7,6 после 24 часовой инкубации при 37°С образуют колонии диаметром от 1 до 3 мм с зоной β-гемолиза шириной 0,5-2,0 мм. Колонии гладкие, круглые, блестящие, серовато-белые. На МПБ через 24-48 часовой инкубации при 37°С наблюдается помутнение бульона с образованием небольшого осадка. Штамм факультативный аэроб, не ферментирует сахаров, не восстанавливает нитраты в нитриты, не образует индол, разжижает желатину, т.е. обладает протеолитической активностью, пептонизирует лакмусовое молоко, дает положительную реакцию на оксидазу.

Штамм бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП» характеризуется следующими свойствами: бактерии представляют собой грамотрицательные диплококки с редко встречающимися кокками диметром 0,7-1,3 мкм, спор не образует. На кровяном ΜΠΑ формирует колонии белого цвета диаметром ≤1 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, зоной β-гемолиза. Факультативный аэроб, не ферментирует сахаров, не образует индол. Не разжижает желатину; дает положительную реакцию на оксидазу и отрицательную - на пробу с лакмусовым молоком. Штамм характеризуется полным набором антигенов, типичных для бактерий рода Moraxella.

Штаммы бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi активно образуют эндотоксины, переходящие в анатоксины под действием тепла и формалина. Продуцируемый токсин обладает гемолитическим и некротическим действиями. LD₅₀ для белых мышей составляет 5×10⁸ микробных клеток. Инактивированные формалином культуры штаммов Moraxella bovis «Г97-ВНИВИ» и Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП» при подкожном введении индуцируют у телят образование специфических антител в сыворотке крови в титрах 1:1280-1:5120, а также формирование специфического иммунитета.

Входящие в состав вакцины антигены в эффективных количествах обеспечивают синергетический эффект, проявляемый в увеличении напряженности и длительности иммунитета.

Пример 1. Получение матровых расплодок штаммов бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi

Для изготовления вакцины берут ампулы с лиофилизированными производственными штаммами Moraxella bovis «Г97-ВНИВИ» и Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП», которые растворяют в 0,5 см³ МПБ и переносят в чашки Петри с 10% кровяным ΜΠΑ. Выращивание проводят в течение 16-18 часов, затем культуры проверяют на соответствие морфологических, культуральных, ферментативных и вирулентных свойств. Если они соответствуют паспортным данным, то их используют для получения бактериальной массы, необходимой для изготовления ассоциированной вакцины.

Штаммы хранят в лиофилизированном виде. Для этого суспензию суточных культур бактерий Moraxella bovis «Г97-ВНИВИ» и Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП» с концентрацией 50 млрд. м. к. в 1 см³ смешивают с защитной средой (снятое молоко с сахарозой 5%, желатиной 1,5%) в соотношении 1:1, расфасовывают в ампулы по 1 см³, высушивают методом сублимации, запаивают ампулы под вакуумом и хранят при температуре +2-8°С.

Пример 2. Выращивание бактериальной массы каждого штамма бактерий Moraxella bovis в отдельности и ее инактивация.

Для получения биомассы культур Moraxella bovis и Moraxella bovoculi используют ΜΠΑ, содержащий 10% дефибринированной крови барана. С этой целью указанную среду в стерильных условиях разливают в 1,5 литровые матровые колбы по 250-300 см³, после застывания среды делают посев указанных штаммов путем внесения в каждый матрас по 5 см³ бактериальной суспензии, содержащей по 1 млрд. м. к. в 1 см³. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37°С. Через 36-48 ч выросшие колонии культур Moraxella bovis и Moraxella bovoculi смывают 0,9%-ным раствором натрия хлорида, готовят суспензию с концентрацией 100-120 млрд. м.к. в 1 см³ по бактерийному или оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Культуру проверяют на чистоту, морфологическую и серологическую типичность.

Инактивацию бактериальной взвеси осуществляют формалином. Для этого в микробную взвесь добавляют формалин с содержанием 37-38% активного формальдегида из расчета 0,5 см³ на 100 см³ суспензии. Перемешивают и ставят в термостат на 72 ч. Затем берут пробу на полноту инактивации, которую проводят путем посева инактивированных микробных взвесей на кровяной ΜΠΑ.

Пример 3. Приготовление вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпес-вируса типа 1.

Вакцину готовят из инактиврованных формалином производственных штаммов бактерий Moraxella bovis «Г97-ВНИВИ» и Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП».

Берут физиологический раствор и к нему добавляют инактивированные суспензии бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovis из расчета 9-10 см³ каждого штамма на 100 см³ вакцинного препарата, а также 6%-ный гель гидроокиси алюминия из расчета 9-10 см³ и формалин 4-5 см³ на 100 см³ вакцины. Доводят рН вакцины до 7,2-7,4 и расфасовывают при тщательном периодическом перемешивании во флаконы, которые потом закрывают резиновыми пробками, обкатывают металлическими колпачками и этикетируют. В таблице 1 приведен состав вакцины.

Пример 4. Контроль вакцины на стерильность, безвредность и на антигенную активность.

Для проверки на стерильность из 6 флаконов вакцины каждой серии делают посевы по 0,2 см³ на МПБ, ΜΠΑ, кровяной ΜΠΑ, МППБ под вазелиновым маслом и агар Сабуро по 2 пробирки на каждый флакон. Посевы со всеми средами выдерживают в термостате при 37°С, а с агаром Сабуро - при 20-22°С в течение 15 суток. Питательные среды должны оставаться стерильными.

Для проверки на безвредность отбирают 10 белых мышей живой массой 17-18 г и вводят им вакцину подкожно в дозе 0,5 см³. Вакцину считают безвредной, если мыши в течение 10 суток после введения вакцины остаются живыми и клинически здоровыми.

Антигенную активность вакцины контролируют на 3-х кроликах живой массой 2,0-2,5 кг, которым вводят препарат подкожно в дозе 2 см³ двукратно с интервалом 14 дней. Через 14 дней после последней вакцинации у кроликов из ушной вены берут кровь и исследуют сыворотку с целью установления уровня специфических антител к антигенам бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi. Титры антител к антигенам бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi должны быть в пределах 10,0-11,0 log₂ в реакции ИФА.

Пример 5. Эффективность вакцины оценивают в неблагополучном хозяйстве по количеству заболевших инфекционным кератоконъюнктивитом крупного рогатого скота. Производственные испытания экспериментальных серий вакцины проведены в СХПК «Енали» Апастовского района; ООО «Хаерби» и ООО «Среднее Девятово» Лаишевского района, совхозе-техникуме Чистопольского района Республики Татарстан, СПК-колхозе им. Калинина и СПК-колхозе им. Кирова Дюртюлинского района Республики Башкортостан, неблагополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту крупного рогатого скота, где заболеваемость телят до 6-месячного возраста составляла 30-56%, молодняка до 12-месячного возраста - 27-36% и молодняка старше года и взрослого поголовья 8-22%. Вакцину применяли с профилактической целью. При этом вакцинировали телят от 1 до 6-месячного возраста в дозе 2,5 см³, молодняка от 6 до 12 мес. в дозе 4 см³, молодняка старше года и взрослого поголовья в дозе 5 см³. Результаты испытаний вакцины в этих хозяйствах представлены в таблице 3. Из этой таблицы следует, что вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота обладает высокой иммуногенной активностью. Применение ее с профилактической целью в 6 стационарно неблагополучных хозяйствах позволило полностью искоренить заболевание в течение года в 4 хозяйствах, а в остальных двух снизить заболеваемость до 1-3%.

Таким образом, предлагаемая вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi обладает более широким спектром действия, повышенной антигенной и иммуногенной активностью, иммунитет у животных сохраняется в течение 12 мес. после вакцинации.

Пример 5. Общие сведения, биологические свойства, порядок применения вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi

Общие сведения

Вакцина изготовлена из концентрированных антигенов бактерий Moraxella bovis (штамм «Г97-ВНИВИ») и Moraxella bovoculi (штамм «СХ-Ч6 №-ДЕП»), инактивированных формалином (0,5% к объему) с добавлением в качестве адъюванта гидроокиси алюминия (10% к объему).

По внешнему виду вакцина представляет собой жидкость желтоватого цвета с белым осадком, легко разбивающимся при взбалтывании.

Вакцина расфасована по 100 и 200 см³ в стеклянные флаконы соответствующей вместимости, укупоренные резиновыми пробками, укрепленными алюминиевыми колпачками.

Флаконы с вакциной упакованы в картонные коробки с разделительными перегородками, обеспечивающими их целостность. В каждую коробку вложена инструкция по применению вакцины.

Срок годности вакцины 12 месяцев с даты выпуска при соблюдении условий хранения и транспортирования.

Запрещено использовать вакцину по истечении срока годности.

Вакцину хранят и транспортируют в сухом темном месте при температуре от 2 до 8°С.

Вакцину следует хранить в местах, недоступных для детей.

Вакцину во флаконах без этикеток с истекшим сроком годности, с нарушением целостностью и/или герметичности укупорки, с измененным цветом и/или консистенцией содержимого, с наличием посторонних примесей, а также остатки вакцины, не использованные в течение 4 часов после вскрытия флаконов, бракуют, обеззараживают путем кипячения в течение 30 минут или обрабатывают 2% раствором щелочи или 5% раствором хлорамина (1:1) в течение 30 минут и утилизируют.

Утилизация обеззараженной вакцины не требует соблюдения специальных мер предосторожности.

Биологические свойства

Вакцина вызывает формирование иммунного ответа у крупного рогатого скота к возбудителям инфекционного кератоконъюнктивита - бактериям Moraxella bovis и Moraxella bovoculi через 14 суток после двукратного введения продолжительностью 12 месяцев.

В 1 см³ вакцины содержится по 10 млрд. инактивированных микробных клеток бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi.

Вакцина безвредна, лечебными свойствами не обладает.

Порядок применения вакцины

Вакцина предназначена для профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в угрожаемых и стационарно неблагополучных хозяйствах.

Запрещено вакцинировать клинически больных и/или ослабленных животных.

Вакцинации подлежит крупный рогатый скот, начиная с 30-35-дневного возраста и старше.

Вакцину вводят подкожно в среднюю треть шеи, двукратно с интервалом 14-15 дней в дозах: телятам от 1 до 6 месяцев - 2,5 см³, молодняку в возрасте от 6 месяцев до года -4,0 см³, взрослым животным - 5,0 см³.

Перед применением вакцину подогревают на водяной бане до температуры 37-38°С, в процессе применения флаконы с вакциной периодически взбалтывают.

Вакцину вводят с соблюдением правил асептики и антисептики, для введения используют стерильные материалы и инструменты. Для каждого животного используют отдельную иглу. Место инъекции обрабатывают 70° спиртом.

Симптомов проявления инфекционного кератоконъюнктивита или других патологических признаков при передозировке вакцины не установлено.

Следует избегать нарушений схемы проведения вакцинации, поскольку это может привести к снижению эффективности иммунопрофилактики инфекционного кератоконъюнктивита. В случае пропуска очередного введения вакцины необходимо провести иммунизацию как можно скорее.

При применении вакцины с настоящей инструкцией побочных явлений, как правило, не отмечается. У отдельных животных через сутки после вакцинации возможно незначительное повышение температуры и формирование припухлости в месте инъекции, самопроизвольно исчезающей через 3-5 суток.

Запрещается применение вакцины, ассоциированной против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, совместно с другими иммунобиологическими препаратами, а также с антигельминтиками и инсектоакарицидами в течение 14 суток до и после очередной иммунизации.

Молоко и продукты от вакцинированных животных реализуют без ограничений независимо от сроков вакцинации.

Меры личной профилактики

При работе с вакциной следует соблюдать общие правила личной гигиены и техники безопасности, предусмотренные при работе с лекарственными средствами ветеринарного назначения.

Все лица, участвующие в проведении вакцинации, должны быть одеты в спецодежду (резиновые сапоги, халат, брюки, головной убор, резиновые перчатки) и обеспечены очками закрытого типа. В местах работы должна быть аптечка первой доврачебной помощи.

В случае попадания вакцины на кожу и/или слизистые оболочки их рекомендуется немедленно промыть большим количеством чистой воды.

При случайном введении вакцины человеку необходимо место укола обработать 70°-ным раствором этилового спирта и обратиться в медицинское учреждение.