СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАДИАЦИОННО-КАДМИЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАДИАЦИОННО-КАДМИЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ

Изобретение относится к радиационной биологии и токсикологии, в частности к получению и использованию радиозащитных и антидотных препаратов при радиационном и химическом поражении.

Известен способ лечения радиационных поражений организма и способ получения препарата для лечения радиационных поражений путем однократного подкожного введения противолучевой сыворотки в течение первых 10 суток после облучения (см. Патент РФ №2169572, МПК А61К 35/28, опубл. 27.06.2001 г.).

Недостатком способа является отсутствие декорпорирующего действия препарата при комбинированном действии на организм ионизирующей радиации и химического токсиканта-кадмия.

Наиболее близким по технической сущности является способ лечения радиационно-кадмиевого поражения организма гамма-радиацией и кадмием путем подкожного трехкратного введения противорадиационного лечебно-профилактического иммуноглобулина в дозе 50 мг/кг и введения в рацион бентонита из расчета 2% от его массы (см. Автореф. дисс. Л.Р.Фаттерахманова «Комбинированное поражение животных гамма-радиацией и кадмием и применение средств терапии». - Казань. - 2008. - 23 с.).

Недостатком способа является раздельное (подкожное) применение противорадиационного лечебного глобулина и длительное (в течение 30 сут) пероральное применение бентонита в составе рациона. При этом установлено, что способ эффективен только при облучении животных в дозе ЛД₅₀ (7,0 Гр), а при применении летальной дозы (9,0 Гр) желаемый лечебный эффект не достигается. Другим существенным недостатком способа является плохая всасываемость бентонита через слизистую оболочку кишечника, поскольку основную массу бентонитовых глин составляют частицы размерами от 0,1 до 0,01 мм, представленные нерастворимыми солями и кварцем, которые, не участвуя в процессе адсорбции токсикантов (радионуклидов, тяжелых металлов), проходят транзитом через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), создавая, таким образом, только дополнительную нагрузку на ЖКТ, что отрицательно сказывается на здоровье животных. При этом токсикант (кадмий), уже всосавшийся в кровь через слизистую ЖКТ, депонируется в критических органах (печень, почки, костный мозг), и поэтому используемый адсорбент (бентонит) при пероральном применении, не достигает цели (клетку-мишень), в которой депонирован тяжелый металл, поэтому и эффективность терапии при комбинированном поражении организма радиацией и кадмием не превышает 60% даже при использовании полулетальных доз ионизирующей радиации (7,0 Гр - ЛД₅₀) и нелетальной дозы (5 ПДК) тяжелого металла - кадмия.

Задачей изобретения является получение монопрепарата за счет конъюгирования (связывания) глобулинов с микрочастицами очищенной фракции природного сорбента-бентонита, повышение лечебно-декорпорирующей активности препарата при комбинированном радиационно-химическом поражении организма за счет адресной доставки лечебного агента (глобулина) к пораженным клеткам-мишеням с одновременной их детоксикацией и метаболической декорпорацией тяжелого металла, снижение дозы бентонита и нагрузки на желудочно-кишечный тракт.

Поставленная задача решается тем, что в способе лечения радиационно-кадмиевого поражения, предусматривающем введение в организм биологического препарата, в качестве специфического препарата используют композицию, состоящую из противорадиационного глобулина и суспензиеобразующей фракции бентонита, которую вводят однократно подкожно в дозах 20-25 мг/кг живой массы и трехкратно через 24, 48, 96 часов при хроническом поступлении тяжелого металла.

Поставленная задача решается и тем, что в способе получения препарата для лечения радиационно-кадмиевого поражения, предусматривают растворение суспензиеобразующей фракции бентонита в противорадиационном лечебном иммуноглобулине, взятом в соотношении 0,3:99,7 соответственно, при постоянном перемешивании и доводят концентрацию сухого вещества до 10%, стерилизуют путем фильтрации, затем разливают во флаконы емкостью 250-300 см³, герметично закрывают и хранят при температуре 4-6°С. А суспензиеобразующую фракцию получают путем предварительной обработки соляной кислотой с последующим удалением дистиллированной водой растворимых частиц солей и кварца, дальнейшим отмучиванием частиц величиной 0,0006-0,0009 мм и их высушиванием.

Существенным отличием способа получения и применения иммунотропно-адсорбционного композиционного препарата для лечения радиационно-химического поражения организма животных является то, что вместо раздельного подкожного и перорального применения двух различных препаратов (лечебного глобулина и бентонита), используют полифункциональный композиционный монопрепарат - нагруженный суспензиообразующей фракцией бентонита противорадиационный лечебно-профилактический глобулин, обеспечивающий экстренную (экстраиммунную) терапию подвергнутого комбинированному радиационно-химическому воздействию организма за счет экстренной адресной доставки детоксицирующего агента - монтмориллонита к пораженным химическим токсикантом (кадмием) клеткам-мишеням - гепатоцитам, стволовым клеткам костного мозга (СКК), а также лимфоцитам - клеткам-мишеням радиационного поражения. Высокий детоксицирующий (антидотный, декорпорирующий) эффект применения композиционного препарата, содержащего микрочастицы бентонита, достигается не только за счет физико-химического связывания (адсорбции) кадмия из корма в желудочно-кишечном тракте (что наблюдается при пероральном применении бентонита), но и участие микрочастиц бентонита в композиции в сложном метаболизме кадмия в организме, при котором ионы цинка, содержащиеся в составе бентонита, обмениваются на ионы кадмия, депонированного в гепатоцитах печени, а ионы цинка, в свою очередь, заменяя кадмий в пораженной клетке, соединяясь с молекулами белка, образуют цинк-металлотионеины (ZnMn), обладающие мощными антидотными (антикадмиевыми) свойствами, декорпорируя пораженную клетку-мишень от токсиканта и ликвидируя последствия кадмиевой интоксикации.

Лечебно-декорпорирующий эффект предлагаемой композиции при комбинированном (радиационно-химическом) поражении организма достигается за счет антирадиотоксического действия иммуноглобулинов, участвующих в нейтрализации радиоиндуцированных токсических радикалов (H⁺, OH^-, H₂O₂, хиноидных и липидных радиотоксинов), ингибируя тем самым апоптозную гибель иммуноцитов (лимфоцитов), изменения метаболизма тяжелого металла в организме, путем эффективного связывания его и выведения из организма с одновременным синтезом цинк-металлотионеинов (ZnMn), участвующих в процессе ликвидации последствий кадмиевой интоксикации. Следовательно, при использовании композиционного препарата достигается синергизм (усиление) радиозащитного и антидотного (антикадмиевого) эффекта, обеспечивающего более высокое и быстрое (экстренное) очищение организма от токсиканта и радиоиндуцированных продуктов оксидативной модификации макромолекул.

Способ получения препарата для лечения комбинированного радиационно-химического поражения и способ лечения комбинированных радиационных поражений организма осуществляется следующим образом.

На первом этапе проводят активирование минерального сорбента - бентонита путем выделения из него наиболее активной высокосорбционной фракции, используя принцип селективного фракционирования монтмориллонитовой фракции глины после разрушения карбонатов, удаления растворимых солей и отмучивания микрочастиц (0,0006-0,0009 мм) бентонита (см. А.с. СССР №952260, М.кл. А61К 39/00, опубл. от 28.08.1982 г., Бюл. №31). Для этого бентонит подвергают специальной обработке. Для разрушения карбонатов глину обрабатывают 1 н. соляной кислотой, а затем 0,1 н. Образовавшиеся растворимые соли и кварц удаляют путем отмывания дистиллированной водой. Для этого глину с помощью воды переносят в вегетационные стаканы (20×12 см). На каждый стакан наносят метки: первая - на высоте 3 см от дна, вторая - на 7 см выше, третья - на 7 см выше второй. Дистиллированную воду доливают до третьей метки, взмучивают в ней бентонит и оставляют на 12 ч для отстаивания. Когда твердая часть глины оседает, а над ней остается прозрачная жидкость, то последнюю удаляют сифоном и вновь наливают дистиллированной воды до верхней метки. Когда суспензия остается во взвешенном состоянии, приступают к отмучиванию частиц величиной 0,0006-0,0009 мм. Для этого в стакан наливают дистиллированную воду до верхней метки, содержимое перемешивают, через 24 ч погружают сифон на глубину 7 см и с его помощью суспензию переливают в стакан-приемник. Отмучивание продолжают до просветления суспензии. В стаканы-приемники к каждой новой порции суспензии добавляют 3-4 капли концентрированной соляной кислоты для коагуляции и осаждения суспензии. Фракцию отмывают дистиллированной водой, а затем высушивают в водяной бане и используют в качестве сорбционного компонента композиционного глобулино-бентонитового препарата.

На втором этапе приготавливают полифункциональную композицию на основе противорадиационного лечебного глобулина и монтмориллонитовой фракции бентонита. Для составления композиции берут определенное количество (например, 100 см³) глобулина (ПРЛГ), содержащего 25-30 мг/мл белка, вносят порошок растворимой (суспензиеобразующей) фракции бентонита (СОФБ) в количестве 29-31 мг на 1 см³ глобулина, смесь тщательно перемешивают, определяют в ней содержание биологически активных веществ (сухого вещества), которое колеблется в пределах 54-61 мг на 1 см³, концентрацию сухого вещества в композиции доводят до 100 мг/мл (10%-ный раствор), затем ее подвергают стерилизации общепринятыми в микробиологии и иммунологии методами.

Полученный по вышеописанному способу композиционный препарат на основе противорадиационного лечебного глобулина (ПРЛГ) и монтмориллонитовой фракции бентонита (СОФБ) используют в качестве средства для экстраиммунной терапии комбинированного радиационно-химического поражения организма на летально облученных и затравленных в летальных дозах кадмия хлоридом лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Способ получения препарата для лечения комбинированного радиационно-химического поражения и способ получения препарата для лечения комбинированного радиационно-химического поражения организма животных иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучение возможности парентерального применения бентонита. Для этой цели из неочищенного (нативного) и очищенной по вышеописанной методике фракции готовили 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 2,0; 3,0%-ные суспензии бентонита на различных жидких средах (воде, сыворотке, лимфе, экстрактах из органов, глобулине). Приготовленные суспензии тщательно перемешивали в жидких средах и через 1, 10, 20, 40, 60 мин после суспендирования по 1 мл подкожно вводили белым мышам. Установлено, что после введения суспензии неочищенного (нативного) бентонита через 1, 10 мин после приготовления суспензий, на месте инъекций у животных под кожей образовывается нерассасывающийся горошек, состоящий из бентонита. При этом отмечено также, что, чем выше концентрация бентонита в суспензии, тем большие размеры имел образовавшийся после инъекции горошек под кожей. После введения суспензий, приготовленных за 20, 40 и 60 мин до введения, образования горошек не наблюдалось, поскольку вся масса бентонита, находящаяся в жидкой фазе, полностью выпадала в осадок, что свидетельствует о нестабильности суспензии и нецелеобразности и невозможности парентерального применения нативного (неочищенного) бентонита.

В отличие от нативного суспензии очищенной фракции бентонита, независимо от срока суспендирования и концентрации микрочастиц бентонита, сохраняли стабильность, оставаясь в жидкой фазе (вода, сыворотка, глобулин) длительное время во взвешенном состоянии и после подкожного введения суспензий на месте инъекций образования горошек не наблюдалось, что свидетельствовало о всасывании введенной жидкости (воды, сыворотки, глобулина с микрочастицами бентонита) в кровь.

Пример 2. Определение токсичности полученного композиционного препарата. Для определения ареактогенности и безвредности полученного препарата, последний в различных дозах (1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0 мг/кг живой массы) перорально, внутримышечно, внутривенно и внутрибрюшинно, одно-, двух- и трехкратно с интервалом 30, 45, 60, 120 мин вводили белым мышам, используя по 6 животных на каждый вариант опыта, учитывая наличие или отсутствие адекватной или неадекватной реакции на препарат. Установлено, что использование препарата при всех вариантах опыта побочных реакций не вызывало: животные были активны, охотно принимали корм и воду, адекватно реагировали на естественные раздражители, что свидетельствует об ареактогенности препарата и переносимости ими использованного диапазона доз, путей и кратности введения.

Пример 3. Изучение декорпорирующей активности суспензиеобразующей фракции бентонита при парентеральном применении препарата. Для этой цели предварительно готовили композиционный препарат на основе сыворотки крови и суспензиеобразующей фракции бентонита путем суспендирования порошка очищенного бентонита в сыворотке крови путем растворения порошка адсорбента из расчета 300 мг на 100 мл сыворотки крови (0,3%-ная суспензия бентонита - 3 мг/мл). Опыты проводили на 45 белых мышах, разделенных на 3 группы по 5 животных в каждой. Животных всех групп однократно перорально затравливали кадмия хлоридом в дозе 1/5 ЛД₅₀ (36 мг/кг - 0,72 мг на мышь). Через 24 ч после затравки животным 1-й группы однократно подкожно вводили композиционный препарат на основе сыворотки крови и суспензиеобразующей фракции бентонита в дозе 1 мл, животные 2-й группы в течение 5 суток после затравки получали корм, содержащий нативный (неочищенный) бентонит из расчета 2% от объема корма (0,3 г - 300 мг бентонита за 1 сут, 1,5 за 5 сут). Затравленным животным 3-й группы никакие препараты не давали и они служили контролем затравки. Для изучения метаболизма тяжелого металла (кадмия хлорида) в организме (накопления и выведения) на фоне применения испытуемых препаратов через 5 сут после затравки животные всех групп были убиты, у них брали пробы из внутренних органов (печень, почки, костный мозг) и определяли в них содержание тяжелого металла на пламенном атомно-адсорбированном спектрофотометре ААС-3.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Из данных таблицы видно, что несмотря на кормление животных 2-й группы в течение 5 суток рационом, содержащим 2% бентонита, наблюдалось незначительное снижение концентрации токсиканта в органах и тканях затравленных животных, которое было ниже в 1,17 (печень), 1,16 (почки, мышцы), 1,19 (костный мозг) раза по сравнению с контролем (Р>0,05). В отличие от известного однократное подкожное введение сыворотки крови, содержащей 0,3% суспензиеобразующей фракции бентонита, приводило к существенному снижению токсиканта (в 2,08 раза в печени, 2,33 - в почках, 1,70 - в мышцах и 2,78 раза - в костном мозге (Р<0,001).

Пример 4. Определение оптимального соотношения компонентов в композиционном препарате. Перед постановкой опытов получали варианты композиционного препарата, содержащие различные количества активированной (очищенной) фракции бентонита в противорадиационном глобулине: 0,1; 0,3; 0,6; 1,2; 2,4; 2,8; 3,0; 3,2% к общему объему препарата. Полученные варианты препарата испытывали на 40 затравленных кадмия хлоридом в дозе 1/5 ЛД₅₀ (31 мг/кг) белых мышах, разделенных на 8 групп по 5 в каждой. Животным 1-й группы через 24 ч после затравки CdCl₂ однократно подкожно вводили глобулино-бентонитовую композицию, содержащую 0,1% активированного бентонита (концентрация 1 мг/мл), 2-й группе - 0,3%-ной суспензии, 3-й - 0,6%-ной, 4-й - 1,2%-ной, 5-й - 2,4%-ной, 6-й - 2,8%-ной, 7-й - 3,0%-ной и 8-й - 3,2%-ной суспензии бентонита в глобулине. Через 5 сут после затравки и введения композиционного препарата животные всех групп были убиты и исследованы на содержание в органах и тканях кадмия. Установлено, что наименьшая концентрация токсиканта была обнаружена в органах и тканях животных, получавших композиционный препарат с содержанием 2,8; 3,0 и 3,2% активированного бентонита, которое составляло в критическом органе (печени) 0,14±0,03; 0,13±0,01 и 0,13±0,03 мг/г соответственно.

Содержание бентонита в глобулине менее 2,8% (2,4; 1,2; 0,6% и т.д.) не оказывало достаточного декорпорирующего эффекта, а повышение концентрации выше 3,0% не приводило к увеличению коэффициента декорпорации.

Пример 5. Определение оптимальной лечебной дозы радиозащитно-антидотного композиционного препарата при парентеральном (подкожном) введении.

Для определения оптимальной лечебной дозы препарата готовили различные концентрации препарата по содержанию биологически активных веществ (БАВ), т.е. содержания сухого вещества (белки-глобулины, бентонит) в нем. Для этого препарат подвергали лиофилизации и полученный осадок растворяли в стерильной кипяченой воде в концентрациях 100,0; 50,0; 25,0; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78; 0,39; 0,19; 0,95 мг/мл. Перечисленные концентрации препарата подкожно однократно вводили облученным в летальной дозе (7,7 Гр) 55 белым мышам (по 5 животных на каждую концентрацию препарата) в количестве по 0,2 мл на животное. Установлено, что при подкожном введении препарата в концентрациях 100,0; 50,0 и 25,0 мг/мл выживаемость животных составляла 80% (выживало 4 животных из 5). При введении животным менее концентрированных растворов наблюдалось постепенное снижение радиозащитной активности препарата с 66,0 до (выживало 3 из 5 животных) 20% (выживало 1 животное из 5). Следовательно, оптимальной лечебной дозой препарата является 20-25 мг/кг. Повышение лечебной дозы до 30,0; 100,0 мг/кг не ведет к возрастанию лечебного эффекта, менее концентрированные растворы (12,5; 6,15 мг/кг) не обеспечивают достаточного эффекта.

Пример 6. Выбор оптимальных доз гамма-лучей и кадмия, вызывающих летальный эффект при сочетанном действии их на организм.

Перед изучением лечебной эффективности композиционного препарата при комбинированном радиационно-химическом поражении организма, с целью моделирования такого поражения, необходимо выбрать оптимальные дозы поражающих агентов, поскольку при таком поражении происходит суммация эффектов отдельных компонентов, которые при изолированном действии не оказывают летального эффекта.

Для этой цели опыты проводили на 50 белых мышах, разделенных на 5 групп по 10 в каждой. Животных 1-й группы подвергали затравке в течение 5 дней кадмия хлоридом (CdCl₂ в дозе 1/5 ЛД₅₀ и облучали γ-лучами в дозе ЛД₅₀ (6,0 Гр); 2-й группы - однократно CdCl₂ (1/4 ЛД₅₀)+γ-лучи (6,0 Гр); 3-й группы - CdCl₂ (5-кратно 1/5 ЛД₅₀)+γ-лучи 7,0 Гр (ЛД₅₀); 4-й группы - CdCl₂ (1-кратно ЛД₅₀)+γ-лучи 6,0 Гр (ЛД₅₀); 5-й группы - CdCl₂ (однократно ЛД₅₀)+γ-лучи (7,0 Гр - ЛД₅₀).

За затравленными и облученными животными вели динамическое наблюдение в течение 30 дней, регистрируя павших и выживших животных в соответствующих группах.

Установлено, что летальность в 1-й группе составила 80%, во 2-й, 3-й, 4-й и 5-й группах - 100%. Следовательно, при комбинированном поражении организма даже нелетальными дозами отдельных компонентов (CdCl₂ - 1/4 ЛД₅₀, γ-лучи - ЛД₅₀), вызывающих в отдельности только 30%-ный и 50%-ный летальный эффект, при сочетанном действии их проявляется 100%-ный летальный эффект, что свидетельствует о синергическом действии поражающих агентов при их сочетанием действии на организм. Поэтому указанные дозы CdCl₂ и γ-лучей были использованы при моделировании радиационно-химического поражения при оценке лечебной эффективности композиционного препарата.

Пример 7. Оценка лечебной эффективности композиционного препарата при комбинированном радиационно-химическом поражении организма. Для оценки лечебной эффективности композиционного препарата на основе противорадиационного глобулина и активированного (очищенного, фракционированного) бентонита (ПРЛГ-Б), опыты проводили на 15 овцах породы «Прекос», 18-месячного возраста со средней живой массой 38±3 кг. Животные были разделены на 3 группы по 5 животных в каждой. Животные 1-й группы получали кадмия хлорид однократно в дозе 1/4 ЛД₅₀ (45 мг/кг) с последующим облучением в дозе 4,2 Гр (ЛД₅₀ для овец); овцам 2-й группы задавали кадмия хлорид в дозе 1/4 ЛД₅₀, облучали в дозе 4,2 Гр и подвергали лечению по известному способу путем однократного подкожного введения противорадиационного лечебного глобулина (ПРЛГ) в дозе 50 мг/кг и перорально в составе рациона скармливали в течение 30 сут неочищенный (нативный) бентонит из расчета 2% от объема кормов; животным 3-й группы однократно подкожно вводили композиционный препарат ПРЛГ-Б в дозе 25 мг/кг живой массы.

За животными вели клиническое наблюдение, регистрируя павших и выживших животных в течение 30 сут после комбинированного радиационно-химического воздействия на животных. Критериями лечебной эффективности испытуемых препаратов служили выживаемость пораженных двумя экологическими агентами (CdCl₂+γ-лучи) животных, выраженность клинического проявления лучевой болезни и кадмиевой интоксикации, а также степень декорпорации (выведения) кадмия из организма, ингибирование синтеза радиомодифицированных оксидативных макромолекул (МДА) и гемотоксичного эффекта у пораженных двумя экологическими агентами животных. Результаты опытов представлены в таблице 2.

Из материалов таблицы видно, что использование известного способа лечения комбинированного радиационно-химического поражения (γ-лучи±CdCl₂) не обеспечивало надежной защиты организма от радиационного и токсического факторов - выживаемость при этом составляла 33,3%. Радиационная гибель животных на фоне интоксикации тяжелым металлом наступала при катастрофической гибели иммуноцитов (лимфоцитов) периферической крови и существенным возрастанием концентрации радиомодифицированных оксидативных макромолекул, вызывающие апоптозную гибель клеток-мишени радиационного поражения (лимфоцитов). Пероральное поступление в организм минерального адсорбента - нативного (неочищенного) бентонита не обеспечивало надежной декорпорации химического токсиканта - содержание кадмия в критическом органе - печени было достаточно высоким, уступая контролю всего в 1,4 раза (Р>0,05).

В отличие от известного, использование предлагаемого средства обеспечивало эффективное лечение радиационно-химического поражения, существенно повышая выживаемость облученных и затравленных CdCl₂ животных, которая составила 80% против 33,3% в известном. Эффективная противорадиационная и антидотная защита при применении предлагаемого способа реализовалась путем нейтрализации токсических радикалов - МДА (в 4,63 раза, Р<0,001), блокирования радиоиндуцированной апоптозной гибели клеток-мишени поражения - лимфоцитов (в 2,69 раза меньше по сравнению с известным) и эффективного выведения токсиканта из органа депо - печени (в 2 раза интенсивнее, чем при известном способе, Р<0,001).

Таким образом, полученный композиционный препарат обладает бифункциональным (радиозащитным и антидотным) свойством, обеспечивая надежное лечение комбинированного радиационно-химического поражения организма и выведения токсиканта (кадмия) из организма, т.е. объединяя в одном препарате лечебные и декорпорирующее свойство, при одновременном уменьшении лечебной дозы противорадиационного глобулина в 2 раза (против 50 мг/кг у известного 25 мг/кг у предлагаемого) и в 30 раз сокращая сроки выведения тяжелого металла из организма, а также уменьшая расход бентонита в 20 раз по сравнению с известным.