Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ЭКСТРЕННОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗА

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно лечению и профилактике инфекционных заболеваний.

Известно применение вакцинных препаратов как для профилактики, так и для лечения бруцеллеза (Толоконская Н.П., Букин В.Н. Теоретические и практические вопросы профилактики, диагностики и лечения наиболее распространенного заболеваний Сибири и Дальнего Востока//Тез. докл. - Новосибирск, 1983,С. - 148-149; Хаев А.Е., Отараева Б.И. Экспериментально-клинический параллели при бруцеллезе в процессе лечения малыми дозами вакцины//Матер.II-Всероссийского съезда инфекционистов - М.:Кемерово, 1983. - С.379-380).

Известно применение антибиотиков для лечения бруцеллеза (Джалилов К.Д., Имомолиев У.П. Бруцеллез у детей. - Медицина, 1990. - С.93-101).

Однако в очаге заражения возбудителем бруцеллеза возникает необходимость экстренного проведения одновременно двух мероприятий: антибиотикотерапии и специфической профилактики болезни. Известно, что одновременность осуществления этих мероприятий не возможна из-за губительного действия антибиотиков - не только на вирулентную, но и вакцинную культуру бруцелл, а разрозненные во времени эти два мероприятия не только технически трудновыполнимы, но и не соответствуют требованиям экстренности.

При бруцеллезной инфекции, на наш взгляд, наиболее эффективной будет схема экстренной антибиотикотерапии с одновременной специфической профилактикой. В этой связи возникает необходимость получения вакцинного штамма бруцелл, который был бы резистентен к антибиотику, применяемому для лечения болезни, но при этом он должен сохранить имммуногенные свойства.

Наиболее близким способом лечения и профилактики бруцеллеза, который следует взять за ближайший аналог, является применение антибиотикаустойчивого мутанта вакцинного штамма бруцелл В. abortus 82 SR для проведения экстренной профилактики бруцеллеза с одновременной антибиотикотерапией заболевания (Крючкова Р.А. «Иммунобиологические свойства стрептомицинрезистентного штамма 82 SR В.abortus и его применение при сочетанной защите животных от бруцеллеза - Автореф. дис… канд. биол. наук. - Казань, 2010. - 22 с).

Недостатком способа является то, что антибиотик стрептомицин, используемый для получения антибиотикорезистентного мутанта бруцелл и лечения бруцеллеза, является недостаточно эффективен и он высотоксичен для макроорганизма, что снижает его терапевтические свойства при этой инфекции.

Целью изобретения является получение антибиотикорезистентного варианта вакцинного штамма бруцелл, обеспечивающего экстренную защиту животных от бруцеллеза при сочетанном применении его с протибруцеллезным препаратом.

Это достигается тем, что в качестве специфического профилактического препарата используют ципролетрезистентный вариант штамма бруцелл В.abortus 82 CR, которой получают путем выращивания исходной культуры бруцелл В.abortus 82 на МППГГА с содержанием 5, 10, 20 мг на мл среды, а в качестве антибактериального препарата - ципрофлоксацин (ципролет). Препараты с профилактической целью вводят внутримышечно за 1-10 дней до начала периода наибольшего риска заражения и в период наибольшего риска заражения. Причем с профилактической и лечебной целью ципролетрезистентный вариант В.abortus 82 CR применяют однократно в дозе 1·10⁹ м.к. в сочетании с ципролетом, который вводят в дозе 1 и 3 мл/кг 2 раза в день в течение 5-7 дней.

Ципролетрезистентный штамм В.abortus 82 CR, обладающий цитокининдуцирующей способностью, усиливая синтез цитокинов: ИЛ-1β ФНО-α и интерферона ИНФ-α, активирует функции фагоцитов, в результате чего возбудитель бруцеллеза, локализующийся и размножающийся внутри фагоцитов, успешно подвергается лизису. Противомикробный препарат широкого спектра действия, в том числе и по отношению к бруцеллам, ципролет, применяемый в сочетании с одновременной иммунизацией вакциной из шт. 82 CR, служит одним из ключевых факторов, который, совместно с цитокинами, способствует уничтожению возбудителя, независимо от его локализации в фаголизосомах или внеклеточной циркуляции в организме. Действующим веществом мощного антибактериального средства - ципролета является ципрофлоксацин, который оказывает влияние на топоизомеразу (ДНК - гиразу) бруцелл, чем способствует подавлению репродукции микробной ДНК. При этом бактерицидное действие препарата на микробы проявляется как в состоянии покоя (как возбудителя, находящегося в фаголизасоме), так и в процессе активного размножения.

Ципролетрезистентный штамм В.abortus 82 CR, используемый для экстренной защиты организма от бруцеллеза, получен из исходной культуры штамма В.abortus 82 путем адаптации его к возрастающим концентрациям антибиотика нового поколения широкого спектра действия из класса хлорфенолонов - ципролета.

Для получения ципролетрезистентного мутанта бруцелл используют в качестве тест - культуры штамм В.abortus 82, который выращивают на пептонно-печеночном глюкозоглицериновом агаре (ППГГА) с содержанием различных концентраций (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0 мг на 1 мл агара) ципролета. Культуру, выросшую ППГГА с минимальной концентрацией ципролета, пересевают на питательную среду с более высокой концентрацией антибиотика и доводят до того состояния, когда она стала расти при содержании ципролета 5,10 и 20 мг/мл среды.

Полученные культуры проверяют на ципролетрезистентность путем 50-кратных последовательных пассажей на ППГГА без ципролета и 2-кратного пассажа через организм морских свинок.

Устанавливают, это после 50-кратных последовательных пассажей на ППГГА и 2-кратного последовательного пассажа через организм морских свинок культура сохраняет ципролетрезистентность.

Штамм характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки. Короткие грамотрицательные палочки с закругленными концами, расположенные поодиночке или парами, без спор и капсул. Размер - 1,2-1,3 мкм, ширина 0,5-0,6 мкм.

Культуральные свойства. Культура штамма хорошо растет на плотных и жидких питательных средах: мясопептонном печеночном глюкозо-глицириновом агаре (МППГГА), мясопептонном бульоне, МППГГА с добавлением перевара Хоттингера, МППГГБ в аэробных условиях. На твердой питательной среде культуры растут в виде выпуклых с ровными краями просвечивающих колоний. При посеве на среде с красками отмечено, что все изучаемые культуры хорошо растут в присутствии фуксина и сафранина, слабо - в присутствии тионина. Лизируется фагом Тб.

Агглютинабельные свойства. Культура штамма агглютинируется S-и R-антибруцеллезными сыворотками.

Антигенные свойства. При введении культуры штамма морским свинкам в дозе 1-10⁶ клеток у животных выявляются специфические анти S- и R- антитела в титрах 10-20 ME, выявляемые S- и R- бруцеллезными антителами в РА, РСК, РДСК и ИФА тест-системах, принятых для диагностики бруцеллеза.

Иммуногенные свойства. В целях экономии лабораторных и сельскохозяйственных животных, а также экспресс-оценки иммуногенности ципролетрезистентного штамма В.abortus 82 CR используют in vitro тест-систему по цитокининдуцирующему эффекту штамма методом иммуноферментного анализа (Шанина Л.Н. Аутоиммунные реакции при инфекционных процессах, методы их коррекции. - Автореф. дисс… д-ра мед. наук.-Саратов, 1983.-40 с).

Учитывая, что центральную, патогенетическую роль в развитии или блокировании бруцеллезного процесса играют медиаторы иммуногенеза-цитокины, в частности интерлейкины (ИЛ-1β, ИЛ-6), интерфероны (циклоферон, ронолейкин, реаферон, а также -γ-интерферон - (γ-ИНФ), фактор некроза опухолей (ФНО-α) (Симбирцев А.Е. Цитокины и воспаление. - 2002. - №1. - С.9-16), экспресс-оценку иммуногенности ципролетрезистентного штамма В.abortus 82 CR проводят по его цитокининдуцирующей активности. В качестве сравниваемых штаммов параллельно используют исходный штамм В.abortus 82 и стрептомицинустойчивый вариант В.abortus 82 SR.

Подготовку реагентов, проведение анализа и оценку результатов проводят согласно «Инструкциям по применению наборов для иммуноферментного анализа цитокинов», приложенным к наборам.

Уровни индуцированной испытуемыми штаммами бруцелл продукции цитокинов (ИЛ-1β, ФНО-α, γ-ИНФ) в супернатантах инкубируемых клеток периферической крови (лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов) определяют с помощью стандартной тест-системы, разработанной в Государственном НИИ особо чистых препаратов (Санкт-Петербург) на основе «Сэндвич» - метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента, а в качестве антител-меченые ферментом антицитокиновые (против ИЛ-1β, ФНО, γ-ИНФ) многоклональные антитела (ст. Лобковой Ю.С. и др. - Цитокиновый профиль как критерий оценки специфической иммунотерапии атопических аллергических заболеваний.-//-Иммунология.- 1999. - №2. - С. 23-32).

По результатам сопоставительного анализа показателей ИФА по оценке цитокининдуцирующей активности испытуемых штаммов бруцелл устанавливают, что ципролетрезистентный штамм В.abortus 82 CR, в отличие от исходного (В.abortus 82) и стрептомицинустойчивого варианта (В.abortus 82 SR), обладает более высокой цитокининдицирующей активностью - наряду с продукцией интерлейкина-1β, ФНО-α, как и исходный штамм-прототип, он дополнительно продуцирует один из важнейших медиаторов иммуногенеза-γ-инферон, играющий ключевую роль в защите организма от бруцеллезной инфекции.

Для подтверждения результатов in vitro тест-системы по экстренной оценке иммуногенности испытуемых вакцинных штаммов бруцелл, проводят общепринятую in vivo тест-систему - оценка иммуногенности штаммов путем заражения иммунизированных испытуемыми штаммами бруцелл вирулентными штаммами возбудителя бруцеллеза. Для этого используют морских свинок, разделенных на 3 группы 10 животных в каждой. Животных 1-й группы иммунизируют подкожно вакциной из штамма В.abortus 82 в дозе 0,46.10⁹КОЕ в объеме 1 см³ в область паха (1 контроль), 2-группы - вакцинной из шт. В.abortus 82 SR (2-контроль), а 3-й группы - испытуемым ципролетрезистентным штаммом В.abortus 82 CR. Через 3 месяца после реиммунизации животных заражают культурой вирулентного штамма В. abortus 54, подкожно, в область паха, со стороны, противоположной методу введения вакцины, в объеме 1 см³ в дозе 83 КОЕ (16 минимально инфицирующих доз).

Спустя 1 мес после заражения, проводят эвтаназию морских свинок с проведением бактериологических исследований. По результатам исследований оценивают эффективность изучаемых вакцин путем определения числа заразившихся и процент защиты от бруцеллеза. Устанавливают, что число заразившихся животных в 1-й группе (вакцина из шт. 82) составляет 10, 2-й (вакцина из шт. 82 SR) - 20% и в 3-й (вакцина из шт. 82 CR) - 0%, что четко коррелирует цитокининдуцирующей активностью оцениваемых штаммов бруцелл.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. В качестве модели воспроизведения экспериментального бруцеллеза были выбраны морские свинки как животные, наиболее чувствительные к этой инфекции. Сорок морских свинок массой 300-350 г разделили на 4 группы по 10 животных в каждый.

Первую группу животных иммунизировали подкожно однократно вакциной из шт.82 SR в дозе 0,46.10⁹КОЕ в объеме 1 см³ в области паха и в течение 10 дней внутримышечно вводили стрептомицин в дозе 20 мг на голову. Животным 2-й группы в течение 10 дней ежедневно вводили только стрептомицин. Животных 3-й группы иммунизировали вакциной из шт.82 CR в аналогичных условиях и внутримышечно вводили ципролет в дозе 0,5 мг на голову 2 раза в день. Животных 4-й группы не иммунизировали и в течение 6 сут вводили ципролет в дозе 0,5 мг 2 раза в день.

Через 14 дней после иммунизации животные всех групп были заражены вирулентным штаммом бруцелл В.abortus 54 в дозе 10 ИД₁₀₀. Через 30 дней после заражения все животные были убиты и проведены бактериологические исследования внутренних органов и лимфоузлов на предмет выявления возбудителя бруцеллеза. В качестве критерия защиты организма использовали индекс инфицированности органов привитых и леченных использованными антибиотиками животных.

Установлено, что процент заразившихся по группам составлял 35,5 (1-я), 75,1 (2-я), 13,3 (3-я) и 20,9 (4-я) соответственно.

Пример 2. Аналогичен примеру 1, но с той лишь разницей, что животные всех групп через 10 дней после иммунизации были заражены вирулентными штаммом возбудителя бруцеллеза В.abortus 54 в дозе 10 ИД₁₀₀. Установлено, что процент заразившихся в 1-й группе составлял 41,7; 2-й - 77,8; 3-й - 4-11,1 и 4-й - 18,3% соответственно.

Пример 3. Аналогичен примеру 1, но той разницей, что иммунизированные вакцинами В.abortus 82SR (1-я группа), В.abortus 82CR (2-я группа), получавшие антибиотики стрептомицин (3-я) и ципролет (4-я группа) животные были заражены вирулентным штаммом возбудителя бруцеллеза через 5 дней после иммунизации и применения антибиотиков.

Установлено, что процент зараживщихся в 1-й группе составлял 43,9; 2-й -79,5; 3-й -10,3 и в 4-й -11,1% соответственно.

Пример 4. Шестьдесят морских свинок заразили вирулентным штаммом возбудителя бруцеллеза B.abortus 54 в дозе 20 ИД₁₀₀. С целью проведения экстренной защиты животных от бруцеллеза путем антибиотикотерапии с одновременной специфической профилактикой заболевания, животным 1-й группы через 3 часа после заражения вводили однократно подкожно с внутренней стороны бедра конечности, с противоположной стороны, куда вводили культуру шт.54, вакцину из штамма 82 SR в дозе 1.10⁶ м.к. Одновременно животным этой группы внутримышечно вводили стрептомицин в дозе 20 мг на голову один раз в день в течение 15 дней. Животных 2-й группы подвергали лечению стрептомицином аналогично таковому 1-й группы; 3-ю группу животных иммунизировали однократно подкожно культурой из шт.82 SR в дозе 1 млн м.к.; животным 4-й группы в аналогичных условиях вводили вакцину из ципролетрезистентного штамма 82 CR и одновременно вводили внутримышечно ципролет; 5-й группы - в течение 6 дней по 2 раза в день вводили ципролет в дозе 0,5 мг на одну голову, 6-ю группу животных иммунизировали однократно подкожно культурой из штамма 82 CR в вышеуказанной дозе.

Через месяц после заражения и лечения испытуемыми средствами животные всех групп были убиты для исследования органов на предмет индикации вирулентного штамма возбудителя, использованного для заражения возбудителем бруцеллеза.

Установлено, что процент выздоровавщих животных в 1-й группе составлял 66,6; 2-й - 33,3; 3-й - 10,0; 4-й - 100,0; 5-й - 83,3 и в 6-й - 66,6% после заражения возбудителем бруцеллеза.

Пример 5. Установлено, что процент выздоровавщих животных в 1-й группе составлял 50,0; 2-й - 16,6; 3-й - 0; 4-й - 90,0; 5-й - 70; 6-й - 60,0%.

Пример 6. Аналогичен примеру 4, но лечение зараженных животных проводили через 10 дней после заражения. Установлено, в 1-й группе процент выздоровевших животных в составлял 33,3; 2-й - 10,0; 3-й - 0; 4-й - 80,0; 5-й - 66,6; 6-й - 50,0%.

Пример 7. Аналогии примеру 4, но лечение зараженных животных проводили через 14 дней после заражения возбудителем бруцеллеза. Установлено, что процент выздоровевших в 1-й группе составлял 16,6; 2-й - 0;3-0; 4-й - 70,0; 5-й - 66,6; 6-й - 50,0%.

Пример 8. Пятьдесят морских свинок заразили вирулентным штаммом возбудителя бруцеллеза В.abortus 54 в дозе ИД₁₀₀. Через 3 ч после заражения морских свинок разделили на 5 группы. Животным 1-й группы вводили вакцину из ципролетрезистентного мутанта В.abortus 82 CR и одновременно внутримышечно вводили ципролет в дозе 1,43 мг/кг 2 раза в день в течение 4 дня; 2-й группы в аналогичных условиях в течение 5 дней; 3-й - в течение 6 дней; 4-й - в течение 7 дней и 5-й группы - в течение 8 дней.

Установлено, что максимальный лечебный эффект наблюдается при сочетанном применении вакцины В.abortus 82 CR и ципролета в течение 5, 6 и 7 дней. При применении антибиотика в течение 4 дней лечебной эффект снижался, а в течение 8 дней эффект не увеличивался, что свидетельствует о том, что оптимальным сроком применения ципролета является введение препарата в течение 5-7 дней после заражения.

Следовательно, результаты этих опытов дают основание считать, что использование ципролетрезистентного штамма В.abortus 82 CR в сочетании с одновременным применением антибиотика нового поколения - ципролета способно предотвратить заражение организма вирулентными штаммами возбудителя бруцеллеза, а заразившихся животных освобождать от присутствия возбудителя бруцеллеза.

Таким образом, использование предложенного мутанта В.abortus CR позволит повысить эффективность проведения противобруцеллезных мероприятий по специфической профилактике и лечению больных бруцеллезом животных в периоды наиболее возможного заражения бруцеллезом (окот овец, отел крупного рогатого скота) и в периоды обслуживания за больными животными в непосредственных очагах поражения бруцеллезом.