Результат интеллектуальной деятельности: РЕАССОРТАНТНЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА RN9/13-HUMAN A(H6N9) ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К НЕЙРАМИНИДАЗЕ ПРИ ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ВАКЦИНАЦИИ

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для диагностических целей при гриппозной инфекции, а также для оценки иммуногенности при вакцинации гриппозными вакцинами.

Современная эпидемическая ситуация по гриппу характеризуется одновременной циркуляцией сразу нескольких сероподтипов вируса семейства Orthomyxoviridae рода Influenzavirus: A(H1N1), A(H3N2) и B. В последнее время проявляется также активизация вирусов гриппа животных и птиц, к которым иммунитет у большинства людей отсутствует. На текущий момент в качестве пандемической угрозы всемирной организацией здравоохранения рассматриваются высоко- и низкопатогенные штаммы вируса гриппа птиц подтипов H5, H7 и H9, получившие широкое территориальное распространение и ассоциированные со спорадическими инфекциями у людей.

По мере создания новых гриппозных вакцин против потенциально пандемических штаммов появляется необходимость всесторонней оценки иммуногенности подготовленных препаратов. Традиционно иммуногенность гриппозных вакцин оценивается по формированию после прививки антител к гемагглютинину (HA) в сыворотке крови [Руководство по проведению клинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 212 с.]. Однако в отношении живых гриппозных вакцин (ЖГВ) до сих пор не было показано прямой связи серологической эффективности, которую оценивают по приростам антигемагглютинирующих антител, с высоким уровнем защитной эффективности. Антитела ко второму поверхностному антигену вируса гриппа - нейраминидазе (NA) также являются одним из факторов защиты против инфекции. Для определения антител к нейраминидазе вируса гриппа ранее применялись реассортантные штаммы на основе вируса гриппа А/лошадь/Прага/1/56(H7N7) с нерелевантным для человека гемагглютинином, содержащие нейраминидазу эпидемических вирусов человека A(H1N1) и A(H3N2) [Вопр. вирусологии. - 1985. - №1. - стр. 35-39]. При этом использовалась реакция ингибирования элюирования вируса с эритроцитов, основанная на блокировании антителами ферментативной активности NA, что препятствовало разрушению агглютинации эритроцитов, вызванной HA вируса гриппа.

Известны реассортантные штаммы RN1/09-swine A(H7N1) и RN2/57-human A(H7N2), применяющиеся для выявления антител к нейраминидазе подтипа N1 и N2 в твердофазной реакции ингибирования сиалидазной активности [Патент РФ 2428476, заявл. 21.06.2010, опубл. 10.09.2011, Бюл. №25; Патент РФ 2464312, заявл. 16.06.2011; опубл. 20.10.2012, Бюл. №29].

Поскольку в настоящее время в циркуляции появились новые варианты вирусов гриппа, такие как вирусы гриппа птиц A(H7N9), приведшие к 165 смертельным исходам среди 450 (36,7%) пациентов с лабораторно-подтвержденной инфекцией, возникла необходимость разработки нового диагностического штамма, содержащего соответствующую нейраминидазу.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение реассортантного штамма для определения антител к нейраминидазе подтипа N9 в твердофазной реакции ингибирования сиалидазной активности и в реакции постадсорбционной микронейтрализации в культуре клеток MDCK. Для этих целей использовали методы классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) вируса А/серебристая чайка/Сарма/51с/06(H6N1) и вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61(H7N9), содержащего поверхностные антигены от вируса гриппа потенциально пандемического подтипа A/Ануи/1/2013(H7N9). Для отбора клонов с нужными свойствами и составом генома проводили ряд селективных пассажей при пониженной до 25°C температуре в присутствии крысиной антисыворотки к штамму А/17/дикая утка/Нидерланды/00/95 подтипа A(H7N3).

Вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9), являющийся реассортантом на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) с формулой генома 6:2, унаследовавшим 6 генов внутренних и неструктурных белков от донора аттенуации, а гены НА и NA - от вируса гриппа A/Ануи/1/2013(H7N9) [Заявка на изобретение №2013159030 от 30.12.2013], был получен из коллекции отдела вирусологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН.

Вирус А/серебристая чайка/Сарма/51 с/06(H6N1) был предоставлен ФГБУ «НИИ гриппа» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Реассортант RN9/13-human A(H6N9) унаследовал ген NA от штамма A/Ануи/1/2013(H7N9). На рис. 1 представлен пример анализа гена NA при помощи обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с праймерами, специфичными для нейраминидазы только одного из родительских вирусов: подтипа N9 (дорожки со 2 по 6) или подтипа N1 (дорожки с 8 по 12). Дорожки на электрофорезном геле имеют следующее соответствие: 1 - ДНК-маркер (100 bp+1.5 Kb, НПО «СибЭнзим»), 2 - ОТ-ПЦР с праймерами к N9 и РНК штамма А/17/Ануи/2013/61(H7N9), 3 - ОТ-ПЦР с праймерами к N9 и РНК штамма А/серебристая чайка/Сарма/51 с/06(Н6М1), 4 - ОТ-ПЦР с праймерами к N9 и РНК штамма RN9/13-human A(H6N9), 5 - ОТ-ПЦР с праймерами к N9 и РНК штамма RN9/13-human A(H6N9) после 5 пассажей в РКЭ, 6 - отрицательный контроль (ОТ-ПЦР с праймерами к N9 в отсутствие вирусной РНК), 7 - ДНК-маркер (100 bp+1.5 Kb, НПО «СибЭнзим»), 8 - отрицательный контроль (ОТ-ПЦР с праймерами к N1 в отсутствие вирусной РНК), 9 - ОТ-ПЦР с праймерами к N1 и РНК штамма А/17/Ануи/2013/61(H7N9), 10 - ОТ-ПЦР с праймерами к N1 и РНК штамма А/серебристая чайка/Сарма/51 с/06(H6N1), 11 - ОТ-ПЦР с праймерами к N1 и РНК штамма RN9/13-human A(H6N9), 12 - ОТ-ПЦР с праймерами к N1 и РНК штамма RN9/13-human A(H6N9) после 5 пассажей в РКЭ. Наличие амплификации РНК реассортанта RN9/13-human A(H6N9), в том числе после 5 пассажей штамма на РКЭ, (4-я и 5-я дорожки) с праймерами к N9 подобно родительскому штамму А/17/Ануи/2013/61(H7N9) (2-я дорожка) и отсутствие ПЦР-продукта (11-я и 12-я дорожки) при проведении полимеразной цепной реакции с праймерами, комплементарными участкам гена NA штамма A/серебристая чайка/Сарма/51 с/06(H6N1), свидетельствуют об идентичности генов NA реассортанта RN9/13-human A(H6N9) и штамма A/Ануи/1/2013(H7N9).

ОТ-ПЦР-рестрикционный анализ шести генов негликозилированных белков [Journal of Virological Methods.- 1995. - №55. - P. 445-446] показал, что все они были унаследованы от холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2).

Идентичность гемагглютинина реассортанта соответствующему поверхностному гликопротеину родительского штамма А/серебристая чайка/Сарма/51с/06(Н6N1) подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Показано также, что HA реассортантного вируса не проявляет перекрестного реагирования с антителами к вирусам гриппа эпидемических подтипов H3 и H1, а также штаммам потенциально пандемических подтипов: H2, H5, H7 и H9. Так, в РТГА с крысиными иммунными сыворотками крови к вирусам гриппа A/Перт/16/2009(H3N2), А/Виктория/361/2011(H3N2), А/Соломоновы острова/3/2006(H1N1), А/Калифорния/1/1966(H2N2), А/утка/Потсдам/1402-6/1986(H5N2), А/дикая утка/Нидерланды/12/2000(H7N3), А/17/Ануи/2013/61(H7N9) или кроличьей антисывороткой к штамму А/Гонконг/1073/99(H9N2) с гомологичным титром 1:100-1:1280 и штаммом А/серебристая чайка/Сарма/51 с/06(H6N1) торможение гемагглютинации отсутствовало даже при минимальном разведении образцов сывороток крови (гетерологичный титр <1:10).

Таким образом, представленный реассортантный штамм обладает антигенной специфичностью гемагглютинина вируса А/серебристая чайка/Сарма/51 с/06(H6N1), что исключает искажение результатов серологических тестов, направленных на выявление антинейраминидазных антител, из-за присутствия в исследуемых образцах сывороток крови также антител к гемагглютинину современных эпидемических и предположительно пандемических штаммов.

Наличие нейраминидазы вируса гриппа N9 делает возможным применение указанного штамма для выявления гомологичных и перекрестно-реагирующих антител к нейраминидазе этого подтипа у лиц, перенесших инфекцию или прошедших вакцинацию гриппозными вакцинами.

Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России под № ГКВ 2777.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

Инфекционная активность реассортантного штамма RN9/13-human A(H6N9) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°C в течение 48 часов - 9,25 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность - 256 ГАЕ/50 мкл.

Паспорт на реассортантный штамм RN9/13-human A(H6N9) прилагается (стр. 6-7).

ПАСПОРТ ШТАММА

вируса гриппа RN9/13-human A(H6N9)

1. Название вируса, штамма (семейство, таксономическая и антигенная группа):

семейство Orthomyxoviridae, род Influenzavirus А, подтип H6N9, штамм RN9/13-human A(H6N9) [А/серебристая чайка/Сарма/51 с/06(H6)×А/Ануи/1/2013(N9)].

2. Выделен (год, место выделения, от кого и из какого материала): штамм получен в апреле 2014 года методом классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах. Характеристика родительских вирусов:

а) вирус гриппа птиц - А/серебристая чайка/Сарма/51с/06(H6N1);

б) вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9), содержащий гены НА и NA от вируса гриппа A/Ануи/1/2013(H7N9), остальные 6 сегментов РНК донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2).

3. Физико-химические свойства (криптограмма, размер, фильтрация, РНК, ДНК):

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

4. Генетические признаки

Состав генома: НА от вируса гриппа птиц А/серебристая чайка/Сарма/51с/06 (H6N1); NA от вируса гриппа A/Ануи/1/2013(H7N9); 6 сегментов РНК, кодирующих внутренние и неструктурные белки (PB2, PB1, PA, NP, M и NS), от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2).

5. Антигенные свойства

Антигенно идентичен гемагглютинину вируса А/серебристая чайка/Сарма/51с/06(H6N1) по данным РТГА с крысиной антисывороткой.

6. Прочие свойства

Штамм RN9/13-human A(H6N9) обладает нерелевантным для человека гемагглютинином и предназначен для специфичного выявления в сыворотке крови антинейраминидазных антител

7. Количество пассажей

10 в процессе реассортации; затем 1 накопительный пассаж в системе развивающихся куриных эмбрионов при температуре инкубации 33°C.

8. Оптимальный титр

Оптимальный титр достигается при культивирования штамма в 10-11 дневных развивающихся куриных эмбрионах при 33°C в течение 48 часов, при этом инфекционная активность штамма составляет 9,25 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл, гемагглютинирующая активность с 0,5% взвесью куриных эритроцитов составляет 256 ГАЕ/50 мкл.

9. Режим высушивания

Вирус лиофилизирован 6 мая 2014 г. Объем материала в ампуле - 1,0 мл, стабилизатор - раствор 13% пептона.

10. Условия хранения

Вирус хранят в виде лиофилизированной суспензии при температуре не выше 4°C. Для восстановления инфекционных свойств необходимы 1-2 пассажа на куриных эмбрионах. Инфекционная активность штамма после лиофилизации - 8,5 ЭИД₅₀/0,2 мл, гемагглютинирующая активность - 64 ГАЕ/50 мкл.

11. Патогенность для человека

Относится к микроорганизмам III группы патогенности.

12. Чувствительность к экспериментальной инфекции (животные, эмбрионы, членистоногие и клеточные культуры)

13. Авторы штамма

Смолоногина Т.А., к.б.н., с.н.с. отдела вирусологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН.

Дешева Ю.А., д.м.н., в.н.с. отдела вирусологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН.

Руденко Л.Г., проф., д.м.н., зав. отдела вирусологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН.

Назначение полученного штамма - качественное и количественное определение антител к NA подтипа N9 в сыворотках крови.

1. Штамм может применяться для выявления антинейраминидазных антител в твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности (РИНА).

Методика такого выявления основана на определении титра антинейраминидазных ингибирующих антител, представляющего собой величину, обратную разведению тестируемой сыворотки, в котором наблюдается 50%-ное снижение сиалидазной активности NA диагностического штамма RN9/13-human A(H6N9). Сиалидазная активность NA определяется по отношению к высокомолекулярному натуральному субстрату (фетуин), сорбированному на полимерном носителе, с использованием специфически связывающего демаскированные полисахариды пероксидазно-меченного лектина.

Для получения иммунных сывороток мышей иммунизируют живым или инактивированным вирусом гриппа различными способами (интраназально, внутримышечно, интраперитонеально). Эвтаназию проводят согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных». Взятие крови осуществляется из подключичной артерии, сыворотки крови отбираются после центрифугирования образцов, прогреваются 30 минут на водяной бане при температуре 56°C и хранятся при -20°C.

Пример выполнения эксперимента 1

Мышам линии CBA вводили интраназально двукратно с интервалом в 21 день реассортантный вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61(H7N9) в дозе 1000 или 100 МИД₅₀/0,05 мл, что эквивалентно 7,0 Ig и 6,0 Ig ЭИД₅₀/0,05 мл. Контрольная группа получила однократно интраназально 50 мкл фосфатно-солевого буфера. Сыворотки крови иммунизированных мышей были получены через 21 день после первой и второй инокуляции.

Пять групп мышей, представленных в таблице 1, различались по уровню сывороточных антител к НА и NA вакцинного штамма: выборочная статистика критерия Краскела-Уоллиса и достигнутый уровень значимости составили H(4,N=30)=21,72, p=0,0002 для РТГА со штаммом А/17/Ануи/2013/61(H7N9); H(4,N=30)=23,52, p=0,0001 для твердофазной РИНА с диагностическим реассортантом RN9/13-human A(H6N9). Дальнейшие множественные парные сравнения, основанные на суммах рангов Краскела-Уоллиса, обнаружили статистически значимые отличия от контрольной группы в титрах антигемагглютинирующих и антинейраминидазых антител только для группы мышей, двукратно иммунизированных высокой дозой вакцинного штамма (см. табл. 1). Титры антител, выявленные в РТГА и твердофазной РИНА в сыворотках крови двукратно вакцинированных 1000 МИД₅₀/0,05 мл лабораторных животных, также были статистически значимо выше, чем аналогичные титры в группе мышей после однократного интраназального введения 100 МИД₅₀/0,05 мл.

Таким образом показано, что только двукратная интраназальная вакцинация дозой 1000 МИД₅₀/0,05 мл эффективно стимулировала выработку сывороточных антител как к гемагглютинину, так и нейраминидазе аттенуированного штамма в отличие от однократной иммунизации указанной дозой вируса или инокуляции 10-кратно более низкой дозы препарата.

2. Штамм может применяться для выявления антинейраминидазных антител в реакции постадсорбционной микронейтрализации (РПН) в культуре клеток MDCK.

Методика выявления основана на оценке влияния антинейраминидазных антител на инфекционный процесс в культуре клеток млекопитающих: присутствие иммуноглобулинов указанной специфичности в поддерживающей среде после стадии первичной адсорбции вируса гриппа на монослое клеток и удаления не связавшихся с клеточными рецепторами вирусных частиц снижает выход вирусного потомства. Титр антинейраминидазных антител в сыворотке крови определяется как наибольшее разведение тестируемого образца, в присутствии которого на протяжении 72 часовой инкубации инфицированного клеточного монослоя вирусные частицы в культуральном надосадке не детектируются по агглютинации эритроцитов кур.

Пример выполнения эксперимента 2

Антинейраминидазные антитела в реакции постадсорбционной микронейтрализации выявляли в сыворотках крови мышей линии CBA из опыта по доклиническому изучению моновалентной ЖГВ А/17/Ануи/2013/61(H7N9), изложенному выше.

Аналогично РТГА и твердофазной РИНА показано, что только двукратная прививка повышенной дозой аттенуированного штамма А/17/Ануи/2013/61(H7N9) эффективно стимулировала выработку антинейраминидазных антител к гомологичному антигену, превышающих по титру соответствующий показатель для группы контроля в среднем в 4 раза (см. табл. 1). Согласно реакции постадсорбционной микронейтрализации с диагностическим реассортантным штаммом RN9/13-human A(H6N9) титры антител к NA в группах, получивших вакцинный штамм в дозе 100 МИД₅₀/0,05 мл как однократно, так и двукратно, а также подвергнутых однократной инокуляции 10-кратно более высокой дозы антигена, статистически значимо не отличались от неспецифического фона в группе плацебо.

Рис. 2 иллюстрирует корреляцию между титрами сывороточных антинейраминидазных антител, выявленных в твердофазной РИНА и РПН. По оси абсцисс представлены титры антител к NA штамма А/17/Ануи/2013/61(H7N9), оцененные в сыворотках крови мышей по ингибированию ферментативной реакции NA диагностического штамма в отношении натурального субстрата-фетуина, выраженные в log₂. По оси ординат представлены титры антител к NA штамма А/17/Ануи/2013/61(H7N9), детектируемые по постадсорбционной микронейтрализации вирусной репродукции в культуре клеток, также выраженные в log₂. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена составил Rs=0,70 (95% ДИ: 0,53-0,81; n=30). Поскольку изложенные методики, направленные на выявление антител к NA, основываются на различных механизмах, то некоторые расхождения можно объяснить их чувствительностью к различным субпопуляциям антинейраминидазных антител.

Результаты экспериментов наглядно демонстрируют пригодность заявляемого реассортантного штамма для выявления антител к нейраминидазе N9 вируса гриппа, благодаря чему этот штамм может быть использован для диагностики, при изучении иммуногенности гриппозной вакцины, для анализа фоновых значений антинейраминидазных антител в человеческой популяции в целом.