Способ демаскирования антигенов при проведении иммуноцитохимических реакций

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим гистологическим исследованиям, проведению иммуноцитохимических реакций, в ходе которых срезы биологического материала изучают под микроскопом на предметных стеклах.

В процессе фиксации тканевые антигены претерпевают конформационные изменения, связанные с коагуляцией белков и образованием перекрестных сшивок при воздействии альдегидов (формальдегида и глутаральдегида) [Fraenkel-Conrat К, Brandon В.А., Olcott H.S. The reaction formaldehyde with proteins IV: Participation of indole groups // J.Biol.Chem. 1947. Vol. 168. №1. P. 99-118; Fraenkel-Conrat K, OlcottH.S. Reaction formaldehyde with proteins VI: Cross-linking of amino groups whith phenol, imidazole, or indole groups // J. Biol.Chem. 1948. Vol. 174. №3. Р. 827-843]. Эти изменения во многих случаях приводят к маскировке антигенных детерминант, с которыми должны взаимодействовать полученные антитела к данным белкам. В результате этого при постановке иммуноцитохимических реакций на фиксированном материале часть антител проявляет недостаточно высокую активность и окрашивание конечного продукта реакции слишком слабое, либо вообще отсутствует. Степень повреждения антигенов зависит от условий фиксации и концентрации альдегидов в фиксирующей жидкости. Считается, что коагулирующие фиксаторы (спирты, уксусная кислота, соли металлов) вызывают меньшую потерю антигенных свойств, чем формальдегид.

Долгое время эта ситуация создавала неразрешимую проблему для использования в иммуноцитохимической диагностике стандартного патологоанатомического материала, то есть фиксированного в формалине и залитого в парафин. При необходимости иммуноцитохимического исследования приходилось использовать замороженный нефиксированный материал или методы мягкой фиксации (холодный ацетон и др.). Найденное в настоящее время решение этой проблемы основано на том, что восстановить антигенные детерминанты, измененные при взаимодействии с формальдегидом, в большинстве случаев позволяет высокотемпературная обработка срезов в водных буферных растворах [Shi S.R., Key М.Е., Kalra K.L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: An enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue section // J. Histochem. and Cytochem. 1991. Vol. 39. №6. P. 741-748]. Этот метод получил название «теплового демаскирования антигенов». Следует отметить, что теоретические основы этого метода пока не разработаны. Тем не менее, многочисленные исследования показывают высокую эффективность теплового демаскирования [Taylor C.R., Shi S.R., Chen С., Young L., Yang C, Cote R.J. Comparative study of antigen retrieval heating methods: microwave, microwave and pressure cooker, autoclave, and steamer // Biotech Histochem. 1996. Vol. 71. №5. P. 263-70; Evers P., Uylings H.B., Suurmeijer A.J. Antigen retrieval in formaldehyde-fixed human brain tissue. Methods. 1998. Vol. 15. №2. P. 133-140; Коржевский Д.Э., Юмкина Е.А. Применение методов демаскирования антигенов на парафиновых срезах головного мозга крысы // Морфология. 2005 Т. 127. №2. С. 76-77; Сухорукова Е.Г., Захряпин М.С., Аничков И.М., Коржевский Д.Э. Выявление микроглии в препаратах головного мозга, длительное время хранившихся в растворе формалина // Морфология. 2012. Т. 142. №5. С. 68-71.].

Разработано множество модификаций способа теплового демаскирования антигенов. Общим для всех этих способов является прогрев срезов, приклеенных к предметным стеклам, в водных растворах до температуры 95-100°С, а в отдельных случаях - и до 120°С при повышенном давлении [Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Петрова Е.С., Карпенко М.Н., Григорьев И.П., Сухорукова Е.Г., Колос Е.А., Гиляров А.В. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии. Руководство (2-е издание, исправленное и дополненное) / под ред. Д.Э. Коржевского. Санкт-Петербург: СпецЛит. 2014. 119 с.].

В качестве растворов для демаскирования могут быть использованы водные растворы солей металлов и буферные растворы с различными рН. В большинстве случаев (если только нет указаний о непригодности этого раствора к конкретным антителам) можно применять цитратный буфер с рН=6,0. Однако в состав этого буфера, помимо цитрата натрия, входит однонормальная соляная кислота, работа с которой требует особой аккуратности и наличия вытяжного шкафа.

Кроме цитратного буфера широко используются EDTA-буфер (рН=8,0) и Tris-EDTA (рН=10,0). Недостаток в изготовлении этих буферных растворов состоит в том, что при их изготовлении необходимо использовать однонормальный NaOH и рН-метр. Ряд производителей антител для обработки рекомендует использовать свои оригинальные буферные растворы (например, S-1700 (Dako, Дания), СС1 и СС2 (Roche-Ventana, США), Bull's Eye Decloaker (Biocare medical, США). Недостатками всех этих буферов является их достаточно высокая стоимость.

Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось создание эффективного способа демаскировки антигенов при иммуноцитохимическом окрашивании, позволяющего добиться столь же хороших результатов, что и при применении дорогостоящих импортных препаратов, но менее затратного как в финансовом отношении, так и в плане трудозатрат, а также более промышленно безопасного, т.е. без использования экологически вредных и опасных для оператора веществ, таких как соляная кислота и едкий натр.

Для решения этой задачи нами предложено в качестве буфера использовать 10% водный раствор тиосульфата натрия (рН=9.0), который обычно используется в медицине, фотографии и других областях [Жоров ГА., Рубченков П.Н., Захарова JI.JI., Обрывин В.Н. Применение натрия тиосульфата в медицине и ветеринарии в качестве полифункционального препарата (обзор литературы) // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2015. №6. С. 68-76; Геворкян К., Федина И.М. История развития фотографии в России // Курорты. Сервис. Туризм. 2013. №2-4 (19-21). С. 133-139; Нагуман П.Н. Химизм и кинетика сульфидирования окисленной меди тиосульфатом натрия // Известия высших учебных заведений. Цветная металлургия. 2008. №6. С. 7-11].

Из оборудования для изготовления этого раствора требуются только лабораторные весы, тиосульфат хорошо растворяется в воде и может быть приготовлен непосредственно перед использованием, а также за 1-2 дня до его использования. Рекомендуется использовать готовый раствор однократно. Низкая стоимость компонентов раствора и простота его изготовления легко позволяет это делать.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Материал для исследования фиксируют в 10% формалине в течение 24 часов при комнатной температуре. Обезвоживают и заливают в парафин любым из рекомендованных для иммуноцитохимических исследований способов. Из парафиновых блоков изготавливают гистологические срезы толщиной от 5 до 10 мкм и наклеивают их на предметные стекла с заранее нанесенным адгезивным покрытием, например, Histo Bond (Marienfeld, Германия)

2. Удаляют парафин и регидратируют срезы обычным способом.

3. После 5-минутной промывки срезов в дистиллированной воде, их в течение 22 минут подвергают процедуре теплового демаскирования в пароварке в сосуде Хелендахела с 10% водным раствором тиосульфата натрия, предварительно прогретым до 45-60°С. По окончании экспозиции крышку пароварки снимают и, не вынимая стекла со срезами из сосуда Хелендахела, дают остыть раствору.

4. Остывшие предметные стекла со срезами промывают дистиллированной водой, оставляют в 0,01 М фосфатно-солевом буфере с рН=7,4 (ФСБ) на 5 мин при комнатной температуре. Буферный раствор может быть приготовлен из таблетированной формы.

5. Аккуратно промакивают фильтровальной бумагой предметное стекло вокруг срезов для образования сухого поля и обводят срезы гидрофобным фломастером (например, DakoPen, Liquid Blocker, PAP Pen и др.), не допуская их высыхания.

6. На срезы наносят достаточное для их покрытия количество блокировочного раствора, например, Protein Block (Spring Bioscience, США) и оставляют при комнатной температуре на 10 мин.

7. Сливают излишек блокировочного раствора и, не промывая препараты, наносят на стекла достаточное количество смеси первичных антител. Например, моноклональные мышиные антитела к глиальному кислому фибриллярному белку (GFAP) астроцитов (клон SPM 507, Spring Bioscience, США) в разведении 1:100. Аккуратно покачивают предметное стекло для равномерного распределения антител. Стекла размещают во влажной камере (например, в квадратные чашки Петри 100×100 мм, SARSTEDT: 82.9923.422, Австралия) и ставят их в термостат с температурой 27°С на 20 часов. Перед началом инкубации в каждую влажную камеру наливают примерно по 5-10 мл дистиллированной воды. В качестве подставок под предметные стекла для предотвращения их контакта с водой можно использовать крышки от маленьких (40 мм) пластиковых чашек Петри.

8. Промывают препараты в трех сменах дистиллированной воды по 5 минут в каждой.

9. Аккуратно удалив со стекол фильтровальной бумагой избыточное количество жидкости, наносят вторичные антитела. Например, против иммуноглобулинов мыши (набор МАСН2, Mouse HRP Polymer (Biocare medical, США)). Аккуратно покачивают предметное стекло для равномерного распределения антител. Стекла размещают во влажной камере и ставят их в термостат при температуре 27°С на 30 минут.

10. Промывают препараты в трех сменах дистиллированной воды по 5 минут в каждой.

11. Аккуратно удалив со стекол фильтровальной бумагой избыточное количество жидкости, наносят необходимое количество рабочего раствора 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорида, например, DAB2-Component (Spring Bioscience, США). В течение 1-3 минут происходит образование окрашенного продукта гистохимической реакции. Этот процесс необходимо контролировать под микроскопом, чтобы остановить реакцию до появления неспецифического фона.

12. Смывают раствор хромогена и промывают препараты в 2-3 порциях дистиллированной воды по 5 мин в каждой.

13. При необходимости препараты подкрашивают гематоксилином или другими гистологическими красителями.

14. Обезвоживают препараты в спиртах восходящей крепости, просветляют в ксилоле обычным образом.

15. Заключают препараты в заключающую среду (полистирол, пермаунт, DPX или другие подобные среды).

Эффективность заявляемого способа иллюстрируется сравнением микрофотографий препаратов астроцитов головного мозга крысы, где на фиг. 1 показан гистологический препарат, обработанный в буфере S-1700 (Dako, Дания), а на фиг. 2 - такой же препарат, обработанный в 10% водном растворе тиосульфата натрия. Отчетливо видно, что демаскирование антигена по заявленному способу осуществляется не хуже, чем при использовании дорогостоящего импортного препарата.

Предлагаемый способ прост для воспроизведения, не требует использования дорогостоящих и опасных для здоровья веществ, позволяет осуществлять исследование архивного материала, хранящегося в парафиновых блоках, подходит для обработки тонких срезов. Результаты иммуноцитохимической реакции, проведенной с использованием тиосульфата натрия, сопоставимы с результатами, полученными с использованием патентованного дорогостоящего буфера для теплового демаскирования генов S-1700 (Dako, Дания).