Результат интеллектуальной деятельности: Реассортантный штамм вируса гриппа В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики гриппа среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа В, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus В, В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория).

В циркуляции появились и широкого распространились новые эпидемические штаммы вируса гриппа В, принадлежащие к антигенной линии В/Виктория. Эти штаммы имеют 6 делеций в нуклеотидной последовательности антиген-презентирующего белка гемагглютинина (НА), которые привели трем аминокислотным заменам (представители В/Гонконг/286/2017 (V1A.2) и В/Вашингтон/02/2019 (V1A.3). Вследствие делеций у новых вирусов гриппа линии В/Виктория возникли антигенные отличия от ранее циркулировавших вирусов, не имеющих делеций (как В/Брисбен/60/2008, VIA) или с одной делецией (как В/Колорадо/06/2017, V1A.1).

В связи с этим, известный вакцинный штамм вируса гриппа линии В/Виктория - В/60/Брисбен/08/83, являющийся прототипом, [Ларионова К.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. «Штамм вируса гриппа В/60/Брисбен/08/83 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей» - Патент РФ №2422517, гос.рег. 27.06.2011] - утратил антигенную актуальность и не сможет вызвать защитную реакцию в случае эпидемии гриппа, вызванной вирусом гриппа, аналогичным вирусу В/Вашингтон/02/2019 (линия Виктория, V1A.3).

Всемирной организацией здравоохранения принято решение о замене состава противогриппозных вакцин на Южное полушарие для эпидемического сезона 2020 г., и на Северное полушарие для эпидемического сезона 2020/2021 и включении в ее состав вакцины к вирусу В/Вашингтон/02/2019 (V1A.3) [World Health Organization. WHO Recommendations on the composition of influenza virus vaccines. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2020 southern hemisphere influenza season. [электронный ресурс] URL: https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2020_south/en/. World Health Organization. WHO Recommendations on the composition of influenza virus vaccines. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2020-2021 northern hemisphere influenza season, [электронный ресурс] URL: https://www.who.int/influenza/vaccines/vims/recommendations/2020-21_north/en/).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса В/Вашингтон/02/2019 (линия Виктория) и безвредного для человека холодоадаптированного донора аттенуации В/СССР/60/69.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопросы вирусологии, 1977. №4. С. 387-395].

Донор аттенуации В/СССР/60/69 - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. С. 66-83].

Донор аттенуации В/СССР/60/69 был получен из эпидемического вируса гриппа В/СССР/69 методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука. 1994. 151 с], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку полноценного противовирусного иммунитета.

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) - от безвредного для человека донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Вашингтон/02/2019 (линия Виктория) с донором аттенуации В/СССР/60/69 путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей трехкратной селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts, са-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств полученного авторами вакцинного штамма В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) показало, что:

а) ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу В/Вашингтон/02/2019 (линия Виктория), поскольку показатели взаимодействия реассортанта В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) и родительского штамма В/Вашингтон/02/2019 (линия Виктория), с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу В/Вашингтон/02/2019 (линия Виктория), полностью совпадали (табл. 1), что так же подтверждено полногеномным секвенированием;

б) второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - проверен методом частичного секвенирования, а также полногеномным секвенированием и идентичен вирусу В/Вашингтон/02/2019 (линия Виктория).

Формула генома. Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали частичное секвенирование ДНК копий генов [Matyushenko V. et. al. Genotyping assay for differentiation of wild-type and vaccine viruses in subjects immunized with live attenuated influenza vaccine. PLoS One. 2017. Vol. 12 №7. P.e0180497. doi: 10.1371/journal.pone.0180497].

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) принадлежат эпидемическому родительскому вирусу В/Вашингтон/02/2019 (линия Виктория), а гены, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации В/СССР/60/69. Результаты анализа всех генов вакцинного штамма В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) представлены в табл.2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации В/СССР/60/69.

Все кодирующие нуклеотидные и аминокислотные замены, охарактеризованные для донора аттенуации В/СССР/60/69, как ответственные за его аттенуацию, присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория). Полное секвенирование генома вакцинного штамма В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) подтвердило, что он унаследовал от донора В/СССР/60/69 полный набор аттенуирующих мутаций.

Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма в куриных эмбрионах с использованием метода частичного секвенирования. Показано, что нуклеотидная последовательность вакцинного штамма В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) до и после его пятикратного пассирования, осталась неизменной.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации В/СССР/60/69.

Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 38°С составила ≤1.2 lg ЭИД₅₀/МЛ, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации составила 6,2 lg ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации В/СССР/60/69.

Фенотипические свойства вакцинного штамма В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) не изменились после его пятикратного пассирования при использовании больших заражающих доз, что свидетельствует о генетической стабильности препарата (табл. 3).

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.: 2010. 39 с] и с «Правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04. 2016. https://rg.ru/2016/09/02/minzdrav-prikaz 199-site-dok.html]

Мышам вводили однократно одну человеческую дозу, соответствующую 0.5 мл, вакцинного вируса внутрибрюшинно в дозе 7.0 lg ЭИД₅₀/мл. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 4) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный реассортантный штамм живой гриппозной вакцины В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса В/Вашингтон/02/2019 (линия Виктория), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека. Штамм аттенуирован и безвреден для мышей.

Морфология штамма полиморфная, типичная для вируса гриппа.

Все это отражено в прилагаемом ниже Паспорте штамма.

Таким образом, вакцинный штамм В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП:Р N003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) депонирован 11.11.2020 в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2969 и имеет характеристики, представленные в паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 72 часов - 8,7 lg ЭИД₅₀/мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:128.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Вашингтон/2019/3676 (линия Виктория) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.