Результат интеллектуальной деятельности: ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ LEGIONELLA PNEUMOPHILA

Изобретение относится к медицинской микробиологии и является элективной питательной средой, которая предназначена для применения в лабораторной практике при выделении легионелл.

Известна питательная среда для выращивания и выделения легионелл BCYE4(см. WHO. Legionella and prevention of legionellesis. WC 200. WHO. 2007), которая имеет следующий состав, г/л: дрожжевой экстракт 10,0; агар Дифко 13,0; уголь Норит N - 2,0; ACES - 10; альфа-кетоглютаровая кислота 1,0; L-цистеин - 0,4; пирофосфат железа 0,25; глицин 3,0; циклогексимид 80,0-100,0 мг/л; ванкомицин 1,0 мг/л; полимиксин В 80-100 тыс. ЕД/л; дистиллированная вода 1 л при рН 7,1.

Недостатком среды является то, что легионеллы весьма чувствительны к перекисным соединениям и рост единичных вирулентных клеток возбудителя на данной среде возможен только при наличии в среде высокоактивного адсорбента, блокирующего действие свободных радикалов - активированного угля, приготовленного по специальной технологии.

Кроме того, среда имеет высокую себестоимость (зарубежное производство), а присутствие в составе циклогексимида отрицательно влияет на человеческий организм ввиду его токсичности.

За прототип выбрана питательная среда для определения антибиотикочувствительности Legionella pneumophila (см. пат. RU №252390, кл. C12Q 1/02, 20.02.2015. Бюл. №5), содержащая, г/л: ферментоаутолизат селезенки 6,0-8,0; агар микробиологический 14,0-16,0; калия фосфат однозамещенный 1,5-1,7; калия фосфат двузамещенный 3,3-3,6; калия глюконат 2,4-2,6; крахмал растворимый 2,4-2,6 желатин 2,4-2,6 мезоинозит 2,4-2,6 L-цистеин 0,3-0,5; ЭДТА железо (III) натриевая соль 0,026-0,028; тушь высококачественная 4,0-6,0; дистиллированная вода до 1 л при рН 7,1.

Однако питательная среда по прототипу имела свое предназначение, а именно определять антибиотикочувствительность, в связи с этим в ней отсутствуют такой сорбент, как активированный уголь, и селективные добавки (антибиотики), обеспечивающие подавление посторонней микрофлоры в исследуемом материале.

Технической задачей предлагаемого изобретения является создание новой селективной питательной среды (СЭЛ) для выделения Legionella pneumophila, обеспечивающей высокую чувствительность и скорость роста.

Поставленная задача достигается тем, что в известной питательной среде для выделения Legionella pneumophila, содержащей питательную основу, агар микробиологический, L-цистеин, мезоинозит, фосфатный буфер и дистиллированную воду, дополнительно для стимуляции роста введен активированный уголь и соль Мора, а в качестве факторов селективности добавлены антибактериальные препараты ванкомицин, полимиксин и амфотерицин, при этом питательной основой является автолизат селезенки крупного рогатого скота при следующем соотношении компонентов, г/л:

Питательную среду готовят следующим образом.

Первоначально формируют основу питательной среды СЭЛ из автолизата селезенки КРС (6,0-8,0) г по сухим веществам, получаемого путем выдерживания суспензии фарша селезенки КРС в присутствии хлороформа при температуре 45°C в течение 90-96 часов и последующего отделения нерастворимого осадка.

Затем к автолизату добавляют: агар микробиологический (12,0-16,0) г; калия фосфата однозамещенного (1,5-1,7) г; калия фосфата двузамещенного (3,3-3,6) г; мезоинозита (2,4-2,6) г и активированного угля (1,5-2,5) г, к указанным компонентам добавляют дистиллированную воду до 1,0 л, устанавливают рН 7,1 при помощи раствора калия гидроксида. Полученную смесь расплавляют при перемешивании в течение 15 мин и автоклавируют 20 мин при температуре 121°C.

В результате получают основу, которая хранится при температуре (2-8)°C в холодильнике в течение 2-х лет.

Для приготовления рабочей питательной среды (СЭЛ) основу расплавляют до температуры 50°C. После этого в нее асептически вводят ростовые добавки: L-цистеин гидрохлорид (0,3-0,5) г/л; соль Мора (0,5-1,0) г/л и селективные добавки: полимиксин В(20,0-40,0) тыс. ЕД/л; ванкомицин (2,0-4,0) мг/л и амфотерицин (4,0-6,0) мг/л. Готовую среду, имеющую черно-серый цвет, разливают в чашки Петри (D 90 мм) по 25 мл. Чашки хранят в герметичном пакете в холодильнике до 60 дней.

Посев легионелл и инкубацию осуществляют в соответствии с существующими правилами (1) при температуре 36°C. Рост легионелл при инокуляции больших посевных доз наблюдается уже через 48 часов, из малых доз - через 72 часа. На среде СЭЛ легионеллы образуют синевато-сероватые плосковыпуклые колонии диаметром не менее 1,0 мм. Стереомикроскопически в косопадающем луче света колонии легионелл зеленоватые или серовато-красноватые с волнисто-волокнистой микроструктурой. На среде BCYEA колонии легионелл сходного цвета и структуры. На безугольной среде колонии бело-серого цвета. При посеве на среду СЭЛ, BCYEA микробов-контаминантов наблюдалось их подавление. На безугольной среде контаминанты прорастали полностью и блокировали рост легионелл.

Основные биологические показатели предлагаемой среды СЭЛ определяют в сравнении с лучшей для выращивания легионелл средой BCYEA и безугольной средой БАЛ (прототип) см. таблицу 1.

С использованием тест-штамма L. pneumophila Philadelphia 1 (АТСС 33152) получены результаты испытаний рецепта среды с различным содержанием ингредиентов - примеры 1, 2, 3, 4, 5. Информация дополнена материалами проверки биологических свойств препарата в оптимальном рецепте на контрольных штаммах L. pneumophila Philadelphia 1 (АТСС 33152) и L. pneumophila Bloomington 2 (АТСС 33155) и полевых штаммах легионелл - пример 6. Эффективность среды при выделении некультивируемых форм легионелл представлена в примере 7.

Пример 1

Для приготовления среды СЭЛ применяют составляющие в следующих концентрациях (г/л): автолизат селезенки КРС 5,0 (в данном и последующих примерах использовали автолизат в жидком виде и дозировали в пересчете на сухое вещество), агар микробиологический 10,0; калия фосфат однозамещенный 1,3; калия фосфат двузамещенный 3,0; мезоинозит 2,2; активированный уголь 1,3. К указанным компонентам добавляют до 1,0 л дистиллированной воды, устанавливают pH 6,9 и расплавляют при кипячении в течение 10 минут, а затем стерилизуют в течение 20 мин при температуре 121°C.

Стерилизованную среду охлаждают до Τ 38°C и при соблюдении правил асептики добавляют ростовые добавки (г/л): L цистеина 0,2; соль Мора 0,3; а также компоненты селективной добавки полимиксин - 0,0024; ванкомицин - 0,001 и амфотерицин 0,003. Готовую среду при тщательном перемешивании разливали в чашках Петри. Среды сравнения - угольно-дрожжевой агар BCYEA и безугольную среду (БАЛ) готовили в соответствии с инструкциями по их применению. Посев контрольных штаммов легионелл и микробов-контаминантов производили согласно общепринятой методике (МУК 3.3.2224).

Как видно из таблицы 1 (вариант 1), опытная среда значительно уступает аналогичным средам как по чувствительности и скорости роста, так и по уровню подавления контаминантов - наличие роста Е. coli 18 при посеве 10⁵КОЕ и рост P. vulgaris 19 с тенденциями к роению при посеве 10² м.к. От среды-прототипа СЭЛ отличается наличием ингибирующей активности, хотя и не столь высокой, как и аналога - среды BCYEA.

Пример 2

Для приготовления среды СЭЛ использовали вышеуказанные ингредиенты (пример 1) в следующих концентрациях, г/л: ферментолизат селезенки КРС 6,0; агар микробиологический 12,0; калия фосфат однозамещенный 1,5; калия фосфат двузамещенный 3,3; уголь активированный 1,5; мезоинозит 2,4. Ростовые добавки в дозах, г/л: L цистеина - 0,3; соль Мора 0,5. Добавки селективные, г/л: полимиксин 0,0025; ванкомицин - 0,002, амфотерицин В 0,004. В ходе приготовления испытания среды использовали методические приемы, идентичные приемам в примере 1.

В таблице 1 (вариант 2) представлены характеристики биологических свойств среды СЭЛ в данной прописи в сравнении с показателями среды прототипа (БАЛ) и аналога (BCYEA). Из таблицы видно, что по скорости роста, чувствительности, среда СЭЛ соответствует нормативам идентичной среде-прототипу. Ингибирующие свойства достигают уровня зарубежной среды при полном отсутствии таковых у среды-прототипа.

Пример 3

Для приготовления среды СЭЛ применяли вышеуказанные реагенты (пример 1, 2) в следующих концентрациях, г/л: ферментолизат селезенки КРС 7,0; агар микробиологический 15,0; калия фосфат однозамещенный 1,6; калия фосфат двузамещенный 3,5; мезоинозит 2,5; активированный уголь 2,0. Ростовые и селективные добавки в дозах, г/л: L цистеина 0,4; соль Мора 0,7; полимиксин 0,003; ванкомицин 0,003; амфотерицин 0,005.

В ходе приготовления и испытания среды использовали методические приемы, идентичные примеру 1. В таблице 1 (вариант 3) приведены ростовые и ингибирующие показатели среды СЭЛ, среды аналога (BCYEA) и прототипа (БАЛ). Как видно из таблицы, среда СЭЛ в данном рецепте обеспечивала скорость роста культуры тест-штамма L. pneumophila Philadelphia в соответствии с существующими требованиям и не уступала показателям зарубежной среды-аналога. Рост контаминантов был подавлен на уровне эффекта среды BCYEA. В данном варианте биологические свойства среды СЭЛ достигали максимальной идентичности с характеристиками среды-аналога и полностью отвечали нормативам.

Пример 4

Для приготовления среды СЭЛ использовали весь набор указанных в предыдущих примерах ингредиентах в следующих концентрациях, г/л: ферментолизат селезенки КРС 8,0; агар микробиологический 16,0; калия фосфат однозамещенный 1,7; калия фосфат двузамещенный 3,6; мезоинозит 2,6; активированный уголь 2,5; L-цистеин 0,5; соль Мора 1,0; полимиксин 0,0029; ванкомицин 0,004; амфотерицин 0,006. В ходе приготовления и испытания среды использовали методические приемы, идентичные приемам в примерах 1, 2, 3. Результаты испытаний представлены в таблице 1 (вариант 4).

Как видно из таблицы, ростовые и селективные свойства среды СЭЛ продолжают соответствовать современным нормам и практически идентичны среде-аналогу.

Пример 5

Для приготовления среды СЭЛ использовали весь набор указанных в предыдущих примерах ингредиентах в следующих концентрациях, г/л: ферментолизат селезенки КРС 9,0; агар микробиологический 18,0; калия фосфат однозамещенный 1,9; калия фосфат двузамещенный 4,0; мезоинозит 2,8; активированный уголь 3,0; L-цистеина 0,7; соль Мора 1,2; полимиксин 0,0035; ванкомицин 0,006; амфотерицин 0,008. В ходе приготовления и испытания среды использовали методические приемы, идентичные приемам в примерах 1, 2, 3, 4 (вариант 5).

В таблице 1 представлены данные результатов испытания биологических показателей среды опытной и известных. В данном варианте СЭЛ снизила свои характеристики как по ростовому, так и по ингибирующим свойствам и вышла за рамки нормативных показателей и не может быть признана эффективным препаратом.

Пример 6

Проверка ростовых свойств оптимального варианта (пример 4) среды СЭЛ в отношении двух контрольных штаммов L. pneumophila и 5-ти полевых штаммов L. pneumophila из объектов внешней среды южного региона страны, в сравнении с ростом на среде-аналоге. Подготовку и контроль сред проводили в соответствии с методическими подходами, использованными в примере 1. Культуру полевых штаммов легионелл готовили по методике, идентичной подготовке контрольных штаммов (см. таблицу 2).

Как видно из таблицы 2, чувствительность и скорость роста всех штаммов легионелл на трех средах была практически идентичной, исключая некоторое снижение скорости роста на среде БАЛ штаммов L. Pneumophila.

Пример 7

Представлены данные о возможности использования селективной среды СЭЛ при выделении легионелл, находящихся в жизнеспособном некультивируемом состоянии (ЖНС) с использованием метода реверсии на сапрофитической культуре Neisseria sp. РПЧИ К-25 из коллекции музея живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института. Индуцировали ЖНС двумя методами - голоданием культуры L. pneumophila Philadelphia 1 (начальная концентрация 10⁷ м.к./мл) в течение 30 дней при температуре (6±2)°C и воздействием на эту же культуру (в концентрации 10⁵ м.к./мл) гидрохинона (0,04 г/л) в течение 40 мин. В таблице 3 представлены результаты эксперимента.

Из таблицы видно, что обе среды обеспечивают в модельном опыте гарантированное выделение легионелл в ЖНС не зависимо от метода индукции данного состояния, обнаруживая в исходном посевном материале от 2 до 20-ти вегетативных клеток при 180-190 колоний легионелл после реверсии с культурой К-25 (хранится в музее Ростовского противочумного института).

Среда СЭЛ доказала свою высокую эффективность в ходе многолетних исследований техногенных источников горячей и холодной воды на предприятиях, гостиничном комплексе и медицинских учреждениях Южного федерального округа. С применением среды СЭЛ было выделено более 300 культур L. Pneumophila, относящихся к 1, 3, 6-14 серогруппам.

Полученные результаты характеризуют новую среду как препарат, соответствующий современным требованиям к средам для выделения легионелл. Высокую эффективность среды СЭЛ подтверждают данные идентичности ростовых и ингибирующих характеристик в сравнении с препаратом-аналогом - референтной средой BCYEA. Как и импортная среда, СЭЛ включена в список препаратов, используемых для выделения L. pneumophila из объектов внешней среды по МУК 4.2.22-17-07.

Таким образом, приведенные данные позволяют сделать вывод о соответствии биологических свойств среды требованиям, предъявляемым диагностическим средам для легионелл МУ 3.3.2.2124-6 (2) и Практическим руководством (3).

Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет высокой биологической активности автолизата селезенки КРС, имеющего в сравнении с ферментолизатом высокую концентрацию аминокислот и низкомолекулярных пептидов, а также сочетание ростовых факторов с селективными добавками с включением надежного сорбента токсичных примесей и перекисных радикалов, получить селективную питательную среду с высокой чувствительностью и хорошими ростовыми показателями.

Особым преимуществом данной среды можно считать ее эффективность при выделении некультивируемых форм легионелл (4). Экономическая целесообразность данного препарата основана на ее низкой себестоимости (до 500 руб./л) и комплектации реагентами исключительно отечественного производства. Государственная регистрация среды включена в сетевой график ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора на 2016 год.

Источники информации

1. Выявление бактерий L. pneumophila в объектах окружающей среды. Методические указания. МУК 4.2.22-17-07, М. - 2007.

2. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза. Методические указания. МУ 3.3.2.2124-06. М. - 2006.

3. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. - М. - 2009. - с. 366.

4. Шелохович А.И., Харабаджахян Г.Д., Карбышев Г.Л. и др. - Сравнительное изучение биологических свойств различных питательных сред, используемых для выделения L. pneumophila / Клиническая лабораторная диагностика. 2009, №10. - с. 45-47.