Способ получения питательной основы сред для выделения и культивирования легионелл

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для изготовления питательных сред в лабораторной диагностике легионеллеза.

В настоящее время легионелезная инфекция является актуальной медицинской проблемой, которая существует в лабораторной диагностике. Несмотря на широкий арсенал питательных сред с использованием основ животного происхождения, есть необходимость в разработке новых сред, которые обеспечивают ростовые свойства легионелл в присутствии факторов селективности, подавляющих рост посторонней микрофлоры.

Известна питательная среда для культивирования легионелл [1], в состав которой входят: ферментативный гидролизат легкого свиньи, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный, активированный уголь, L-цистеин гидрохлорид, эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов (из куриных зародышей 9-ти дневных), агар микробиологический.

Недостатком известной среды является многокомпонентность питательной основы из сырья животного (из натуральных компонентов), что изначально делает ее мало стандартной. Авторы не предлагают вариант среды для выделения легионелл, питательная основа которой, как правило, обладает более высокими ростовыми свойствами.

Известна питательная среда для выращивания легионелл [2], основой которой является мясная вода до 1000 мл, пептон ферментативный 10,0 г, натрия хлорид 5,0 г, кровь 10,0 мл, агар-агар 15,0-20,0 г при рН 7,3.

Однако среда имеет низкую эффективность и относительно высокую себестоимость.

Известна также питательная среда плотная для выращивания легионелл [3], содержащая ферментативный гидролизат желтка куриного яйца, дигидрофосфат калия, активированный уголь (АУ), L-цистеин гидрохлорид, агар-агар и дистиллированную вода.

Недостатком известной среды является многокомпонентность питательной основы из сырья животного что изначально делает ее мало стандартной.

Наиболее известной является импортная питательная среда угольно-дрожжевой агар (УДА) [4]. Ее недостаток - дороговизна не производимого в РФ препарата и использование нестабильной ростовой добавки.

За прототип выбран способ получения питательной основы микробиологических сред [5], заключающийся в использовании в качестве субстрата селезенку крупного рогатого скота (КРС), которую подвергают автолизу при рН 3,4-3,8 и смесь выдерживают в течение трех-четырех суток при 42-45°С с корректировкой рН на том же уровне.

Однако в данном способе фарш селезенки разводят водой, доводят соляной кислотой рН 3,4-3,7, добавляют хлороформ (до 2%) и при температуре 42-45°С проводят автолиз с периодическим перемешиванием и коррекцией рН до исходного уровня. По истечении 3 суток смесь кипятят, фильтруют через бельтинг или ватно-марлевый фильтр и доводят рН до 7,0. Полученная данным способом питательная основа - автолизат селезенки (АС) обладает хорошими ростовыми свойствами в отношении кишечной группы микробов и возбудителей ООИ.

Недостатком способа является то, что для легионелл данный препарат оказался малопригоден из-за низких ростовых свойств сред на его основе, что указывает на наличие токсических для легионелл компонентов.

Технической задачей предполагаемого изобретения является разработка нового способа получения основы питательной среды для выделения и культивирования легионелл имеющих высокие ростовые свойства, пониженное содержание различных токсичных примесей угнетающих рост легионелл.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения питательной основы сред для выделения и культивирования легионелл, включающем основу в виде гомогенизованной селезенки крупных сельскохозяйственных животных с последующим автолизом, фарш селезенки в количестве 5 кг перед автолизом предварительно отмывают в емкости с 15 л дистиллированной воды в соотношении 1:3, перемешивают вручную в течение 30 минут, после этого отделяют осадок центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 мин при температуре (20-25)°С, надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в соотношении 1:2 дистиллированной водой в количестве 10 л, затем корректируют реакцию смеси до рН 3,0, вносят 2% хлороформа, 0,5 г/л активированного угля и проводят автолизат в термостате при температуре (45-50)°С в течение 96 часов с периодическим перемешиванием не более одного, двух раз в сутки, после этого автолизат осветляют центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 мин, разливают в стеклянные баллоны объемом 25 л с завинчивающейся полиэтиленовой крышкой и сохраняют в холодильнике под 1% хлороформом при температуре (2-8)°С

Технология осуществления способа показана в примерах 1-9.

Данные о ростовых свойствах среды СЭЛ на основе (АСО) осветленного автолизата в сравнении с АС (прототипом) представлены в таблицах (пример 1-9). Контрольной средой служил угольно-дрожжевой агар (УДА) Oxoid.

Пример 1.

Изучение ростовых свойств СЭЛ с АСО на L. pneumophila Philadelphia 1 (вариант 1).

Для получения основы субстрат селезенки (фарш) в количестве 5 кг смешивают вручную в течение 30 минут с дисциллированной водой 15 л в соотношении 1:1. Осадок отделяют центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 минут при температуре (20-25)°С. Надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют в соотношении 1:2 дистиллированной водой в количестве 10 л с последующим перемешиванием. Затем доводят смесь до рН 3,0, вносят 2% хлороформа, 0,2 г/л активированного угля перемешивают в течение 1 мин. Автолизат проводят в термостате при температуре (45-50)°С в течение 96 часов с периодическим (1 раз в сутки) перемешиванием.

После этого автолизат осветляляют центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 мин., разливают в стеклянные баллоны объемом 25 л с завинчивающейся полиэтиленовой крышкой и сохраняют в холодильнике под 1% хлороформом при температуре (2-8)°С

Полученный осветленный автолизат (АСО) вносят в состав среды СЭЛ [6], в дозе 7,0 г/л (по сухим веществам), добавляют активированный уголь - 4,0 г/л, агар микробиологический 12,0 г/л, мезоинозит - 2,5 г/л, корректировали рН до 7,1. Смесь расплавляют кипячением в течение 50 мин, после чего разливают по флаконам 400 мл, укупоривают резиновыми пробками, герметизируют алюминиевыми колпачками и стерилизуют автоклавированием.

Применяют основу в составе СЭЛ для культивирования легионелл следующим образом: среду расплавляют на водяной бане, а затем в охлажденную до температуре 45-50°С среду стерильно добавлялют L-цистеин гидрохлорид 0,4 г/л, соль Мора 0,75 г/л. В качестве селективной добавки вносят полимиксин 2,5-2,9 мг/л, ванкомицин 2,0-4,0 мг/л и амфотерицин 25,0-30,0 мг/л. Сформированную таким образом среду культивирования разливают по 30 мл в чашки Петри. На среду засевают по 0,1 мл взвеси вирулентного штамма L. pneumophila Philadelphia 1 с концентрацией 10⁴, 10³ и 10² КОЕ/мл и культивируют 120 часов при температуре 36°С. Средой сравнения была СЭЛ с автолизатом селезенки (АС), полученным по методу прототипа в той же концентрации - 7,0 г/л по сухим веществам. Контрольной средой выбрана среда OXOID с ростовыми добавками и селективными добавками [4], смотри таблицу 1.

Как видно из таблицы 1, АСО - вариант 1 с основой, полученной при соотношении субстрат-жидкость 1:1 и автолиза в присутствии 0,2 г/л активированного угля не дал заметного эффекта, рост единичных колоний легионелл на опытной среде и варианте-прототипа был отмечен только при посеве 1000 КОЕ через 96 часов инкубации. На контроле рост из 10 КОЕ через 72 часа культивирования.

Пример 2. Изучение ростовых свойств СЭЛ с АСО на L. pneumophila Philadelphia! (вариант 2).

Для получения основы, субстрат селезенки смешивают с дисциллированной водой в соотношении 1:2, перемешивают 30 мин. Осадок отделяют центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 минут, доводят объем дисциллированной водой до исходного, вносят активированный уголь в дозе 0,3 г/л, устанавливают рН 4,0. Затем проводят автолиз при температуре (45-50)°С в течение 96 часа. Осадок отделяют центрифугированием, автолизат сохраняют в холодильнике под хлороформом при температуре(2-8)°С.

Полученный осветленный автолизат - АСО вариант 2 вносят в состав среды СЭЛ в дозе 7,0 г/л (по сухим веществам), добавляют активированный уголь - 4,0 (2,0) г/л, агар микробиологический 12,0 г/л, мезоинозит - 2,5 г/л, корректировали рН до 7,0 г/л. Смесь расплавляют кипячением в течение 50 мин, после чего разливают по флаконам объемом 400 мл, укупоривают резиновыми пробками, герметизируют алюминиевыми колпачками и стерилизовали автоклавированием.

К данной основе питательной среды при температуре 45-50°С добавляют ростовые и селективные добавки по варианту 1 и засевают тест-штаммом легионелл по варианту 1. В качестве контрольной среды использовали среду OXOID с ростовыми и селективными добавками (см. таблицу 2).

Как видно из таблицы 2, предлагаемая технология позволила получить видимый рост легионелл на среде СЭЛ через 96 часов из посевной дозы 1000 КОЕ/мл. На основе-прототипа рост наблюдался только через 120 часов из дозы 1000 КОЕ/мл в сравнении с контрольной средой, которая обеспечила рост единичных колоний из 10 м.к. уже через 72 часа.

Пример 3.

Изучение ростовых свойств СЭЛ с АСО на L. pneumophila Philadelphia 1 (вариант 3).

Для получения основы субстрат селезенки смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:3, суспендируют 30 мин. Осадок отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок ресуспендируют до исходного объема с дистиллированной водой, корректируют рН 3,0, вносят хлороформ и автолизовали известным способом в присутствии 0,3 г/л активированного угля. Из автолизата удаляют осадок и готовят осветленный автолизат АСО вариант 3, затем изготавливают и контролируют питательную среду СЭЛ по примеру 1(см. таблицу 3).

Как видно из таблицы 3 предлагаемый вариант технологии позволяет получать видимый рост легионелл на среде СЭЛ уже через 72 часов из посевной дозы 100 м.к. и через 96 часа из 10 м.к. на основе-прототипа рост из 1000 м.к. наблюдался через 120 часов. Контрольная среда обеспечила рост легионелл из 10 м.к. такж е через 72 часа.

Пример 4.

Изучение ростовых свойств СЭЛ с АСО на L. pneumophila Philadelphia 1 (вариант4).

Для получения основы субстрат селезенки смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:3, суспендируют 30 мин. Осадок отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок ресуспендируют до исходного объема с дистиллированной водой, корректируют рН 3,0, вносят хлороформ и автолизуют известным способом в присутствии 0,4 г/л активированного угля. Из автолизата удаляют осадок и готовят АСО вариант 4(см. таблицу 4). Изготавливали и контролировали среду СЭЛ по примеру 1.

Как видно из таблицы 4 уже через 72 часа предлагаемый вариант технологии позволил получить видимый рост легионелл на среде СЭЛ из посевной дозы 10 и 100 м.к. На основе - прототипа рост из 1000 м.к. наблюдался через 120 часов. Контрольная среда обеспечивала рост легионелл из 10, 100 и 1000 м.к. через 72 часа.

Пример 5.

Изучение ростовых свойств СЭЛ с АСО на L. pneumophila Philadelphia 1 (вариант5).

Для получения основы субстрат селезенки смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:3, перемешивают в течение 30 мин. Осадок отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок ресуспендируют до исходного объема с дистиллированной водой, корректируют рН 3,0, вносят хлороформ и автолизуют известным способом в присутствии 0,5 г/л АУ. Из автолизата удаляют осадок и готовят АСО вариант 5. Изготавливали и контролировали среду СЭЛ по примеру 1 (см. таблицу 5).

Как видно из таблицы 5 предлагаемый вариант технологии позволил получить видимый рост легионелл на среде СЭЛ уже через 48 часов из посевной дозы 100 м.к. и через 72 часа из 10 м.к. на основе-прототипа рост из 1000 м.к. наблюдался через 120 часов. Контрольная среда обеспечивала рост легионелл из 10 м.к. через 72 часа.

Пример 6.

Изучение ростовых свойств СЭЛ с АСО на L. pneumophila Philadelphia 1 (вариант 6).

Для получения основы субстрат селезенки смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:3, перемешивают 30 мин. Осадок отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок ресуспендируют до исходного объема с водой дистиллированной, корректируют рН 3,0, вносят хлороформ и автолизуют известным способом в присутствии 0,6 г/л активированного угля. Из автолизата удаляют осадок и готовят АСО вариант 6 (см. таблицу 6). Изготавливали и контролировали среду СЭЛ по примеру 1.

Как видно из таблицы 6 предлагаемый вариант технологии позволил получить видимый рост легионелл на среде СЭЛ уже через 48 часов из посевной дозы 100 м.к. и через 72 часа из 10 м.к. на основе-прототипа рост из 1000 м.к. наблюдался через 120 часов. Контрольная среда обеспечивала рост легионелл из 10 м.к. через 72 часа.

Изучение ростовых свойств СЭЛ с АСО на L. pneumophila Philadelphia 1 (вариант 6).

Пример 7.

Изучение ростовых свойств СЭЛ с АСО на L. pneumophila Philadelphia 1 (вариант 7).

Для получения основы субстрат селезенки смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:3, суспендируют 30 мин. Осадок отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок ресуспендируют до исходного объема с водой, корректируют рН 3,5, вносят хлороформ и автолизуют известным способом в присутствии 0,7 г/л активированного угля. Из автолизата удаляют осадок и готовят АСО вариант 7 (см. таблицу 7). Изготавливали и контролировали среду СЭЛ по примеру 1.

Как видно из таблицы 7 предлагаемый вариант технологии позволил получить видимый рост легионелл на среде СЭЛ только через 72 часа из посевной дозы 100 м.к., через 72 часа из 10 м.к. роста не было. На основе-прототипа рост из 1000 м.к. наблюдался через 120 часов. Контрольная среда обеспечивала рост легионелл из 10 м.к. через 72 часа.

Пример 8.

Изучение ростовых свойств СЭЛ с АСО на L. pneumophila Philadelphia 1 (вариант 8).

Для получения основы субстрат селезенки смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:4 и далее осуществляют получение автолизата АСО вариант 8 в присутствии активированного угля 0,5 г/л. Изготавливали и контролировали среду СЭЛ по примеру 1 (см. таблицу 8).

Как видно из таблицы 8 предлагаемый вариант технологии позволил получить на опытной среде видимый рост через 72 часа из 100 м.к. Рост из 10 м.к. наблюдался только через 96 часов. На основе-прототипа рост из 1000 м.к. обнаруживали через 120 часов инкубации. Контрольная среда обеспечивала рост легионелл из 10 м.к. через 72 часа.

Пример 9.

Представлены данные по испытанию селективной среды СЭЛ на основе АСО используя вариант 5 в сравнении с и средой-прототипом на АС на наборе штаммов из коллекции «Музея живых культур» ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института, включая тест-штаммы и штаммы легионелл, выделенные из объектов окружающей среды Южного федерального округа (посев 100 м.к. учет через 72 часа). На среду-протопит сеяли 1000 м.к. и учитывали через 120 часов.

Как видно из таблицы 9 предлагаемый вариант технологии позволил получить видимый рост (от 1,0 мм) легионелл всех серогрупп на среде СЭЛ на АСО стабильно через 72 часа из посевной дозы 100 м.к. На основе-прототипе рост из 1000 м.к. наблюдался не всех серогрупп при среднем диаметре колоний 0,1-0,3 мм. Рост легионелл на контрольной среде незначительно превышал рост всех серогрупп легионелл на искомой среде.

Таким образом результаты проверки селективных свойств среды СЭЛ на основе прототипа и искомого автолизата (см. таблицу 10) показывают, что основа полученная по предложенному способу обеспечивает возможность выделения легионелл при посеве 10 м.к. через 72 ч. инкубации при практически полном подавлении роста контаминантов- кишечные палочки, антракоида и вульгарного протея и соответствует по этому показателю референтной среде . Среда на основе прототипа позволяет обнаруживать рост легионелл только через 120 ч. при отсутствии ингибирующего эффекта в отношении антракоида и вульгарного протея.

Использование предполагаемого изобретения позволяет за счет процесса отмывки и современного процесса осветления субстрата после автолиза понизить содержание натрия хлора в конечном продукте с токсичных для легионелл 0,9% до индифферентных 0,2%, а отказ от кипячения при завершении автолиза позволяет минимизировать образование в готовом продукте перекисных радикалов, одним из показателей присутствия которых является удельная цветность готовой продукции, последняя достигается с 2-х и 3-х кратным сокращением срока осветления при абсолютной прозрачности полученного субстрата.

Таким образом предложенная новая технология получения основы питательной среды для выделения и культивирования легионелл имеет высокие ростовые свойства, пониженное содержание различных токсичных примесей угнетающих рост легионелл.

Источники информации

1. Ковтун Ю.С., Катунина Л.С., Таран А.В. и др. Питательная среда для культивирования легионелл. Патент. RU №2412240 10.09.2006.

2. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб. 2008. с. 64-65.

3. Катунина Л.С., Темежникова Н.Д., Куличенко А.Н. и др. Питательная среда плотная для выращивания легионелл. Патент. 2460768 10.09.2012.

5. Милютин В.Н., Копылов В.А., Буряков Б.Г., Шеремет О.В., Пасхалова Л.В., Хазан М.А., Борисов Б.И. Способ получения питательной основы микробиологических сред). Патент №1222676. 8.12.1985.

6. Шелохович А.И., Харабаджахян Г.Д., Савельева И.К., Терентьев А.Н., Ульрих Е.П. Питательная среда для выделения Legionella pneumophila. Патент №2580227 от 14.03.2016 г.

7. Нестерин М.Ф., Скурихин И.М. Химический состав пищевых продуктов. М. Пищевая промышленность. 1979. 247 с.

8. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза. Методические указания. МУ 3.3.2.2124-06, М., - 2006.

9. Темежникова Н.Д., Тартаковский И.С.«Легионеллезная инфекция.» М. 2007. 260 С.