Результат интеллектуальной деятельности: Способ дифференциации штаммов Yersinia pestis на основной и неосновные подвиды методом ПЦР в режиме реального времени

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано при экспресс-диагностике возбудителя чумы, а именно при определении принадлежности штаммов Yersinia pestis к основному или неосновным подвидам.

Проблема ускоренной дифференциации штаммов возбудителя чумы остается актуальной несмотря на существующие биохимические, серологические, морфологические и современные молекулярно-биохимические методы, наиболее используемым из которых является полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Возбудитель чумы относится к виду Yersinia pestis, который включает штаммы основного подвида, способные быть эпидемически опасными для людей и штаммы неосновных подвидов (altaica, caucasica, hissarica, ulegeica), эпидемически не опасные. Выяснение вопросов эпидемической значимости штаммов является важным условием правильного и эффективного эпидемического анализа и контроля за чумой. Кроме того, внутривидовая дифференциация штаммов возбудителя чумы является необходимым инструментом для полной характеристики выделенных культур Yersinia pestis.

Известен способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом секвенирования (см. патент RU №2404256, C12Q 1/68, 2011.2010 г.), заключающийся в выделении хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведения ПЦР с использованием праймеров AraC-s/AraC-as и RhaS-s/RhaS-as, секвенирования амплифицированных фрагментов и дифференциацию по подвидам путем сравнения полученного генотипа с генотипами основного и неосновных подвидов.

Известен также способ дифференциации штаммов Yersinia pestis различных подвидов и биоваров методами ПЦР и мультилокусного сиквенс-типирования (см. патент RU №2471872, кл. C12Q 1/68, C12N 15/11, 10.01.2013 г.), который предусматривает амплификации фрагментов генов парА, rhaS, glpD, araC, определение их нуклеотидной последовательности, установление генотипа по нуклеотидам, находящимся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, 773 гена araC, 613, 1021 гена nарА и по делеции 93 п.н. (в позиции 9-111) гена glpD, и выявление сиквенс-типа штамма Y. pestis по определенным аллелям используемых генов с последующей дифференциацией штаммов путем сравнения установленного сиквенс-типа с сиквенс-типами различных биоваров основного и неосновных подвидов.

Однако указанные известные способы сложны, трудоемки, требуют значительных материальных затрат, дорогостоящего оборудования и реагентов, участия высококвалифицированного персонала. Все это необходимо в виду того, что одним из этапов исследования является определение нуклеотидной последовательности фрагментов генов. Подобные исследования могут быть проведены только в крупных специализированных лабораториях диагностических и референс-центров с использованием дорогостоящих оборудования, реагентов и программ для анализа полученных результатов.

Известен также способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба (см. патент RU №2332464, кл. C12Q 1/68, 27.08.2008 г.), включающий проведение ПЦР с использованием праймеров, комплементарных nutG - YPO1967 области возбудителя чумы.

Однако в качестве мишеней ДНК использованы VNTR локусы, которые характеризуются значительной вариабельностью. Этот метод сложен в исполнении, трудновоспроизводим, требует применения набора референтных штаммов и имеет все недостатки методов с электрофоретическим способом учета результатов.

За прототип выбран способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Yersinia pestis (см. патент RU 2404251, кл. C12Q 1/00, 20.11.2010 г), в котором определяют к какой группе относится исследуемый штамм в ПЦР с помощью праймеров CDS39, мишенью которых является ДНК плазмиды рМТ у штаммов неосновных подвидов.

Недостатком этого метода является отсутствие учета результата реакции в режиме реального времени, а так же невозможность идентифицировать штаммы при утрате плазмиды, несущей мишени для праймеров.

Следовательно ни один из перечисленных способов, за исключением последнего, не позволяют в одной реакции в диагностической лаборатории первого уровня провести дифференциацию штаммов основного и неосновных подвидов и оперативно с минимальными материальными затратами определить эпидемическую значимость исследуемого микроорганизма.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового, в режиме реального времени, эффективного, достоверного способа дифференциации штаммов Yersinia pestis на основной и неосновные подвиды.

Поставленная задача достигается тем, что способ дифференциации штаммов Yersinia pestis на основной и неосновные подвиды методом ПЦР в режиме реального времени, включает выделение хромосомной ДНК из исследуемого материала, постановку ПЦР со специфическими праймерами и аллельспецифическими зондами и учет полученных результатов, причем амплификацию исследуемой ДНК проводят с помощью сконструированных праймеров:

при этом первый зонд содержит в своем составе флуоресцентную метку FAM и гаситель флуоресценции RTQ1, а второй - с флуоресцентной метку HEX и гаситель флуоресценции BHQ2, учет результатов дифференциации происходит автоматически на мониторе компьютера в виде кривых и в численных значениях, отражающих уровень флуоресцентного свечения определенной длины волны, если возникает флуоресцентный сигнал с длиной волны 516 нм, характерный для флуорофора Fam, то определяют наличие в пробе ДНК основного подвида, а если детектируют свечение флуорофора Hex с длиной волны 556 нм, то делают заключение о наличии в пробе ДНК штаммов неосновных подвидов Yersinia pestis.

При этом ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит: олигонуклеотидные праймеры и зонды - каждый по 5 пМ, 1хбуфер (2,5хПЦР-буфер - 10 мкл), MgCl₂ - 1,0 мМ, смесь dNTF -9,25 мМ, Taq ДНК полимераза - 9,5 ед., исследуемая ДНК - 5 мкл.

Кроме того, ПЦР проходят с соблюдением режимов:

1 этап - 95°С - 3 мин;

2этап - 95°С - 15 сек;

3 этап - 63°С - 40 сек,

при этом повтор 2 и 3 этапов 40 раз.

Обоснование выбора праймеров и зондов.

В ходе работы по сравнительному анализу нуклеотидных последовательностей хромосом штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов нами была выявлена единичная нуклеотидная замена в положении, соответствующем позиции 3054 в гене AJJ88233.1, ответственном за синтез белка ftsK, предположительно участвующим в сегрегации ДНК. У штаммов Yersinia pestis основного подвида в этой позиции находится нуклеотид аде-нин, а у штаммов неосновных подвидов - гуанин. Этот фрагмент гена был использован в качестве мишени для конструирования аллельспецифических зондов, комплементарных последовательностям ДНК соответствующим каждой из групп штаммов. Для амплификации в ПНР фрагментов ДНК, содержащих мишени для зондов и в соответствии с нуклеотидной последовательностью зондов (для учета температуры плавления) были сконструированы и синтезированы праймеры, которые являются универсальными для всех штаммов Yersinia pestis.

Зонды позволяют проводить детекцию специфических продуктов ПЦР гибридизуясь на них и в последствии разрушаясь под воздействием Taq-полимеразы во время различных этапов амплификации, что приводит к началу флуоресцентного свечения флуорофоров. Используются аллельспецифические зонды, один из которых ftsKProbaA (5`-aactggtacagaaAcaactgataca-3`), содержащий в своем составе флуоресцентную метку FAM, гаситель флуоресценции RTQ1, позволяет выявлять штаммы основного подвида по наличию в амплифицированном фрагменте нуклеотида аденина, в положении, соответствующем позиции 3054 в гене AJJ88233.1, а второй зонд, с флуоресцентной меткой HEX и гасителем флуоресценции BHQ2- ftsKProbaG (5`-ggtacagaaGcaactgatacaaaa-3`), выявляет в том же положении подобного фрагмента нуклеотид гуанин и соответственно штаммы всех неосновных подвидов.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед постановкой ПЦР проводят предварительную подготовку исследуемого материала, а именно выделение ДНК из штаммов Yersinia pestis. Первоначально обеззараживают культуру путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000, прогреванием при 56°С в течении 30 минут и последующим добавлением лизирующего раствора на основе гуанидинизо-тиоционата. ДНК из клеток возбудителя чумы выделяют стандартным образом, описанным в МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

Следующий этап заключается в составлении реакционной смеси для ПЦР. Последняя включает: олигонуклеотидные праймеры и зонды- по 5 пмоль: праймеры (5`-tcatcgttggtgtcagttgc - 3`) и ftsKrev (5`-tggcgatgatgacgttt - 3`) и два аллельспецифических зонда, один из которых ftsKProbaA (5`-aactggtacagaaAcaactgataca -3`), а второй зонд, с флуоресцентной меткой Hex и гасителем флуоресценции BHQ2- ftsKProbaG (5`- ggtacagaaGcaactgatacaaaa -3`). Смесь также содержит 1хбуфер (2,5 хПЦР-буфер - 10 мкл), MgCl₂ - 1,0 мМ, смесь dNTP - 0,25 мМ, Taq DNA полимеразу - 0,5 ед., исследуемую ДНК - 5 мкл.

После этого осуществляют постановку реакции амплификации в автоматическом детектирующем амплификаторе ДТ322 (ДНК-технология, Россия) или ДТ-Lite (ДНК-технология, Россия) или BioRad CFX 96 (Bio-Rad Laboratories,Inc.) в котором заданы следующие условия амплификации: 1 этап - 95°С - 3 мин; 2 этап- 95°С - 15 сек; 3 этап- 63°С- 40 сек с детекцией, при этом повтор 2 и 3 этапов 40 раз.

Учет реакции амплификации происходит автоматически в ходе проведения ПЦР с помощью детектирующего амплификатора. При наличии в исследуемой пробе ДНК штаммов основного подвида с фрагментом ДНК амплифицируемом в ПЦР с помощью используемой пары праймеров гибридизуется зонд ftsKProbaA так как является комплементарным ему (фрагменту), а последующее разрушение зонда при воздействии Taq-полимеразы приводит к началу флуоресцентного свечению флуорофора Fam с длиной волны 516 нм, которое регистрируется прибором. При наличии в исследуемой пробе ДНК штаммов неосновных подвидов с фрагментом ДНК гибридизуется зонд ftsKProbaG, комплементарный именно этому участку в штаммах неосновных подвидов и в дальнейшем происходит регистрация флуоресцентного свечения флуорофора Hex, связанного с зондом, которое регистрируется прибором, настроенным на длину волны 556 нм.

Учет детекции флуоресцентного свечения по различным длинам волн в амплификаторе отражается на мониторе компьютера, связанного с прибором, в виде графиков на которых представлены кривые и численные значения отражающие уровни флуоресцентного свечения определенной длины волны, соответствующие каждой пробе взятой для исследования.

Следовательно, основным преимуществом предлагаемого изобретения является:

- использование режима учета ПЦР в реальном времени;

- отсутствует необходимость проводить определение нуклеотидных последовательностей различных генов;

- метод может быть применен на любом этапе лабораторного исследования возбудителя, относящегося к I группе патогенности;

- дифференциация ДНК штаммов на основной и неосновные подвиды происходит в одной пробирке;

- мишенью для праймеров и зондов является хромосомная ДНК.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Дифференциация в модельном эксперименте по подвиду штамма Y. pestis 231 и штамма Y. pestis 243, представляющих основной подвид. Штаммы получены из коллекции ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора.

Выделение ДНК штаммов Y. pestis проводят с помощью лизирующего раствора на основе гуанидинизотиоцианата с предварительным обеззараживанием культуры путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 и прогреванием при температуре 56°С в течение 30 мин (МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности»). Основным этапом является постановка ПЦР с выделенной ДНК в автоматическом детектирующем амплификаторе с использованием предложенных праймеров и зондов. ПЦР проводят при использовании программы амплификации: 1) 95°С - 3 мин, 2) 95°С - 15 сек, 3) 63°С - 40 сек с детекцией, 4) повтор 2 и 3 этапов 40 раз.

Результаты ПЦР учитываются в реальном времени. Учет результатов (см. рисунок 1) свидетельствует о наличии флуоресцентного сигнала с длиной волны 516 нм, характерной для флуорофора FAM как в случае с ДНК штамма Y. pestis 231-А2, так и в случае с ДНК штамма Y. pestis 243-А5. Результаты ПЦР в пробах с положительным контрольным образцом - А6 и в отрицательном контроле - А8 подтверждают достоверность проведенной реакции.

Пример 2. Дифференциация в модельном эксперименте по подвиду штаммов Y. pestis 336, Y. pestis 1724 и Y. pestis 2377, представляющих один из неосновных подвидов. Штаммы получены из коллекции ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора.

Выделение ДНК из штаммов происходит по методике, описанной в примере 1. Программа и условия проведения амплификации сходные.

Результаты амплификации, представленные на рисунке 2, свидетельствуют о наличии в пробе ДНК штаммов относящихся к неосновным подвидам, так как прибором в пробах А1, A3, А4, в которых находится ДНК Ypestis 336, 1724 и 2377 соответственно, детектируется флуоресцентное свечение молекулы флуорофора - HEX (556 нм), связанной с зондом, идентифицирующем ДНК штаммов неосновных подвидов. Результаты разных уровней детекции в положительной и отрицательной контрольной пробе: А7 и А8 соответственно подтверждают полученный результат.

Таким образом, отличительной особенностью предлагаемого способа является использование в качестве ДНК-мишеней фрагмента гена AJJ88233.1, несущего в своем составе единичную нуклеотидную замену, которая позволяет различать штаммы основного и неосновных подвидов с помощью аллельспецифических зондов, ранее не применявшихся для внутривидовой дифференцации Yersinia pestis.

Использование предполагаемого изобретения позволяет за счет набора реагентов, включающего два праймера и два аллельспецифических зонда проводить исследование ДНК в ПЦР в одной пробирке, учет осуществлять автоматически и исключить потерю идентификационных возможностей за счет того, что мишенью является хромосомная, а не плазмидная ДНК и нет опасности элиминации плазмиды из микробной клетки. Эти обстоятельства подтверждают то, что применение нового способа повышает эффективность внутривидовой дифференциации и позволяет оперативно определять эпидемиологическую значимость исследуемых штаммов.