Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПСОРИАЗА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальному моделированию патологических состояний, в частности псориазу, и может найти применение при изучении механизмов патогенеза данного хронического дерматоза и создания этиопатогенетического лечения псориаза.

Псориаз является одним из самых распространенных хронических дерматозов, которым страдает от 1 до 5% населения мира. В связи со значительной распространенностью заболевания, хроническим, зачастую тяжелым течением, несовершенством имеющихся методов лечения, неясностью этиологии и патогенеза проблема псориаза является одной из актуальных в медицине [см. «Системные аспекты псориаза: интегральная модель, основанная на кишечной этиологии» Ричардс Дуглас, Меин Эрик, МакМиллин Дэвид, Нельсон Карл. Оригинал - "Integrative Medicine", spring 2000, vol. 2, № 2, рр. 105-113(9). Перевод на рус.; «Состояние микрофлоры толстой кишки у больных хроническими дерматозами» / Г.Ю. Курников, И.А. Клеменова, Г.И. Жукова, Н.Ю. Воронова // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2002. - №3. - С. 38-39; Baker, B.S. Recent advances in psoriasis: the role of the immune sistem / B.S. Baker. - Imperial College Press, 2000].

Известна роль стрептококковой фокальной инфекции в возникновении каплевидного и бляшечного псориаза [см. /Маринина Г.Н. Лечение псориаза / Г.Н. Маринина, В.С. Маринин. - Харьков, 2007. - 104 с.]. В приведенной работе и в ряде последующих исследований [см. Псориаз и описторхоз: морфогенез гастроинтестинопатии / Г.И. Непомнящих, С.А. Хардикова, С.В. Айдагулова, Г.А. Лапий. - М., 2003. - 175 с.; /Системные аспекты псориаза: интегральная модель, основанная на кишечной этиологии/ Ричардс Дуглас, Меин Эрик, МакМиллин Дэвид, Нельсон Карл. Оригинал - "Integrative Medicine", spring 2000, vol. 2, № 2, рр. 105-113(9). Перевод на рус./Состояние микрофлоры толстой кишки у больных хроническими дерматозами / Г.Ю. Курников, И.А. Клеменова, Г.И. Жукова, Н.Ю. Воронова // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2002. - №3. - С. 38-39; Baker, B.S. Recent advances in proriasis: the role of the immune sistem / B.S. Baker. - Imperial College Press, 2000]. Короткий Н.Г., Песляк М.Ю. /Псориаз как следствие включения β-стрептококков в микробиоценоз кишечника с повышенной проницаемостью (концепция патогенеза) // Вестник дерматологии и венерологии 2005; N1: С. 9-18] было показано, что основными β-стрептококковыми антигенами, провоцирующими и поддерживающими хронический псориаз, служат BSP-антигены (β-streptococci proteins) - стрептококковые клеточные и мембранные белки, являющиеся продуктами распада β-гемолитического стрептококка.

Исследования проводились на двух группах пациентов. Первая группа больных псориазом, вторая - атопическим дерматитом. Проведенными исследованиями выявлено наличие β-гемолитического стрептококка у 85% обследованных больных хроническим бляшечным псориазом. При микробиологическом исследовании микрофлоры кишечника больных атопическим дерматитом β-гемолитический стрептококк отсутствовал.

В результате были сделаны выводы о наличии связи между возникновением псориаза и присутствием β-гемолитического стрептококка в организме человека.

Известны способы моделирования различных заболеваний у лабораторных (экспериментальных) животных, по клинической патологии приближенные к аналогичным заболеваниям человека. Эти способы помогают исследователям изучать течение конкретного заболевания и находить новые методики лечения с разработкой различных фармакологических препаратов.

Исследования последних лет свидетельствуют о возможной роли вирусов в развитии псориаза. При этом в псориатических высыпаниях в различные десятилетия нашего столетия обнаруживались кокки, грибы, спирохеты, различные включения.

Известно, что животные болеют псориазом с такими же изменениями на коже, что и люди (см. статья В. Корсун, А. Корсун «Можно ли заразиться псориазом?» http://www.lor.inventech.ru/derma/psoriasis-0010.shtml).

Проведенные патентные исследования и анализ научной медицинской литературы показал, что конкретные рекомендации по моделированию псориаза не известны.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ моделирования псориаза у экспериментальных животных (см. статья А. Анисимовой «Изучение роли β-гемолитического стрептококка в патогенезе псориаза в экспериментальных условиях», опубликованного на VI международной студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум» 15 февраля-31 марта 2014 года, http://www.scienceforum.ru/2014/search/). Этот способ заключается в том, что крысам перорально вводят культуру β-гемолитического стрептококка, полученную на питательной среде, в виде взвеси в воде в течение 21 суток. На 21 сутки у крыс опытной группы менялась поведенческие реакция, проявляющаяся в повышенной агрессивности. На 35-45 сутки у крыс появилась яркая папулезная сыпь. Кожные элементы были представлены красноватыми пулами с четкими границами, покрытыми серебристо-белыми чешуйками. Чешуйки легко отделялись при поскабливании с образованием гладкой блестящей поверхности «терминальной пленки», при снятии которой выступали мелкие кровяные капельки. Обнаруженные у крыс кожные элементы полностью соответствовали элементам сыпи больных псориазом со всеми характерными для этой болезни дифференциально-диагностическими признаками.

Однако использование известного способа показало, что описанные симптомы появляются не у всех крыс, а у некоторых крыс, особенно при увеличенной концентрации вводимого раствора появились симптомы других заболеваний, которые в конечном результате привели крыс к летальному исходу. Это объясняется отсутствием конкретной дозировки и последовательности введения культуры бактерий β-гемолитического стрептококка, что препятствует созданию адекватной модели псориаза, увеличивает летальность экспериментальных животных.

Задачей изобретения является создание адекватной модели псориаза при снижении летальности экспериментальных животных - крыс.

Техническим результатом заявляемого изобретения является увеличение количества адекватных моделей псориаза, которые могут быть использованы для исследования и апробации новых способов лечения псориаза, а также исключение летальности экспериментальных крыс.

Этот технический результат достигается тем, что при моделирования псориаза путем выпаивания крыс в течение 21 суток культурой бактерий β-гемолитического стрептококка, полученной на питательной среде, в виде взвеси культуры в воде в соответствии с изобретением содержание бактерий составляет 10⁵-10⁹ КОЕ/мл и вводят 1 мл взвеси 1 раз в день.

Способ создания модели псориаза осуществляют на белых крысах линии Вистар массой 180-200 г, которых методом случайных чисел делят на 4 группы по 10 особей в каждой. Животные первой группы не получали культуру β-гемолитического стрептококка (группа А). Крысам второй группы вводили культуру β-гемолитического стрептококка посредством выпаивания 1 раз в день 1 мл питьевой воды, содержащей культуры бактерий β-гемолитического стрептококка в концентрации 10⁵-10⁹ КОЕ/мл (группа В). Животные из третьей группы получали культуру бактерий β-гемолитического стрептококка в концентрации, большей 10⁹ КОЕ/мл (группа С), а из четвертой группы в концентрации, меньшей 10⁵ КОЕ/мл (группа D) (дневник наблюдений за результатами представлены в табл. 1).

Культура β-гемолитического стрептококка на питательной среде готовилась в условиях клинической лаборатории Республиканской клинической больницы №1 г. Чебоксары, Чувашская республика, после чего в этой же лаборатории готовилась взвесь культуры необходимой концентрации. Животные первой группы не получали культуру бактерий β-гемолитического стрептококка (группа А). Крысам второй группы вводили в течение 21 суток путем выпаивания 1 раз в день 1 мл питьевой воды, содержащей культуру β-гемолитического стрептококка в концентрации 10⁵-10⁹ КОЕ/мл (группа В). Животным из третьей группы вводили в течение 21 суток путем выпаивания 1 раз в сутки 1 мл питьевой воды, содержащей культуру β-гемолитического стрептококка, в концентрации, большей 10⁹ КОЕ/мл (группа С), а из четвертой группы взвесь в концентрации, меньшей 10⁵ КОЕ/мл (группа D). Все крысы содержались в одинаковых условиях с одинаковым питанием.

На протяжении всего времени проведения эксперимента, у крыс первой группы не отмечалось каких-либо заметных изменений в состоянии здоровья, несмотря на близкое расположение клеток с животными исследуемых групп (рис. 1) и одинаковые условия содержания и питания.

На 35-45 сутки у всех крыс второй группы появилась яркая папулезная сыпь. Кожные элементы были представлены красноватыми пулами с четкими границами, покрытые серебристо-белыми чешуйками. Чешуйки легко отделялись при поскабливании с образованием гладкой блестящей поверхности «терминальной пленки», при снятии которой выступали мелкие кровяные капельки. Обнаруженные у крыс кожные элементы полностью соответствовали элементам сыпи больных псориазом со всеми характерными для этой болезни дифференциально-диагностическими признаками (рис. 2). Необходимо отметить, что у 7 крыс третьей группы на 20-45 сутки - летальный исход, у 3 - обширное поражение кожи в виде воспалительного процесса - пиодерма (рассеянные пустулы, папулы, гиперемия кожи) (рис. 3). У 8 крыс четвертой группы не отмечалось каких-либо заметных изменений в состоянии здоровья, а также каких-либо кожных проявлений (рис. 4), но у двух появились некоторые проявления агрессивности. На 45 сутки проведено вскрытие крыс всех 4 групп с забором органов для гистологического исследования. Забор материала для исследования микрофлоры разных отделов кишечника крыс проводился следующим образом. После вскрытия животного выделяли кишечник на стерильный лоток. Для удобства каждый отдел кишечника был отделен хирургическими зажимами. В первую очередь проводили забор полостной микрофлоры. Для этого в стерильные пробирки путем механического вытеснения помещали содержимое каждого отдела. Перед забором пристеночной микрофлоры каждый отдел кишечника промывали в стерильном 0,85% изотоническом растворе с целью удаления остатков содержимого кишечника. Далее стерильной петлей методом соскоба со стенок осуществляли забор пристеночной микрофлоры. Материал сразу же погружали в стерильные закрытые пробирки и доставляли в лабораторию для исследования. Выделение микроорганизмов осуществляли в соответствии с «Методическими рекомендациями по диагностике и лечению дисбактериоза кишечника» (1986), разработанными в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского. идентификацию микроорганизмов проводили на основании «Определителя микроорганизмов Берджи» и «Справочника по микробиологическим и вирусологическим методам исследования» на стандартных дифференциально-диагностических средах с помощью «Систем индикаторных бумажных», выпускаемых Нижегородским научно-исследовательским институтом микробиологии и эпидемиологии (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / по ред. М.O. Биргера. - М.: Медицина, 1982. - 462 с.; Количественное определение бактерий в клинических материалах / Ю.М. Фельдман, Л.Г. Маханева, А.В. Шапиро, В.Д. Кузьменко // Лабораторное дело. - 1984. - №10. - С. 616-618).

Материал помещали в стерильный флакон. Для приготовления основного разведения (1:10) после взвешивания материала во флаконы добавляли недостающее количество фосфатного буферного раствора и тщательно встряхивали в течение не менее 5 минут до получения однородной массы фекалий. Для определения количества кишечных палочек и бактерий, относящихся к группе кишечной палочки в 1 г фекалий, производили посев из основного разведения на среду Эндо и на кровяной агар по методу Голда в модификации Ю.М. Фельдмана (Количественное определение бактерий в клинических материалах / Ю.М. Фельдман, Л.Г. Маханева, А.В. Шапиро, В.Д. Кузьменко // Лабораторное дело. - 1984. - №10. - С. 616-618). Для выделения стафилококков материал засевали на желточно-солевой агар, бифидобактерий - на среду Блаурокка, лактобактерий - на стерильное молоко, условно-патогенных грибов - на среду Сабуро, других факультативно-анаэробных микроорганизмов - на шоколадный агар.

Гистологические препараты органов крыс из первой группы не выявили каких-либо патологических изменений (рис. 5). На рис. 5 изображен препарат толстой кишки первой группы. Препарат выглядит однородным, структура не нарушена. Крипты четкие, хорошо выражены, глубокие. Основные клетки идут в ряд, бокаловидных клеток меньше, как положено. В собственной слизистой имеются тучные клетки от 3 до 5 на 1 крипту, лимфоциты 4-5 на 1 крипту, макрофаги 1-2 на 1 крипту. Эти клетки имеют упорядоченный вид, расположены на некотором расстоянии друг от друга, не скапливаются. Подслизистая оболочка хорошо сращена с мышечным слоем. В мышечном слое лимфоциты встречаются редко. Лимфоциты находятся в лимфоидных узелках.

Патоморфологическое исследование показало формирование патологических изменений во внутренних органах крыс второй группы, которые происходят в ответ на внедрение микробных агентов β-гемолитического стрептококка в организм. В результате происходит антигенная стимуляция, в ходе которой развивается иммунологическая реакция отторжения. Значительное количество лимфоцитов с током крови проникает в органы и системы организма, в том числе и в кожу, с формированием признаков иммунологического воспаления (рис. 6). На рис. 6 представлен препарат толстой кишки животного второй группы, окрашенный гематоксилин-эозином. Препарат выглядит неоднородным, структура нарушена, в некоторых местах крипты сглажены и инфильтрированы тучными клетками, лимфоцитами. Крипты неравномерно утолщены, происходит их склеивание. Между криптами обнаруживается огромное скопление лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов, тучных клеток. Увеличено количество бокаловидных клеток и изменена их структура. Происходит усиленная дегрануляция тучных клеток (из 7 клеток 3 дегранулированных), а также образование конгломератов из тучных клеток и многоядерных форм, около которых видны бактерии. Подслизистая оболочка отделена от мышечной 2 слоями, между ними содержится большое количество жировых клеток. Увеличено число миобластов. Обнаружено разрушение лимфоидного аппарата - нет лимфоидных бляшек.

Крысы группы С (рисунки не представлены). У 7 крыс с летальным исходом - все внутренние органы обсеменены по типу сепсиса. У 3-х крыс - изменение внутренних органов сходно с изменениями у крыс группы В, где были проявления псориаза и тоже есть обсеменение органов крыс микроорганизмами, но в гораздо большей степени, чем в группе В, а в группе крыс Д - нет никаких проявлений во внутренних органах - как и у крыс группы А, которые не получали культуру стрептококка.

Таким образом, использование совокупности существенных признаков изобретения позволяет увеличить количество адекватных моделей псориаза, которые могут быть использованы для исследования и апробации новых способов лечения псориаза, а также исключить летальность экспериментальных крыс при получении моделей.