Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АМИЛОИДОЗА У ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии и может быть использовано для экспериментальной апробации методов профилактики и лечения системного амилоидоза.

Проблема амилоидоза в связи со старением человеческой популяции и увеличением числа больных, имеющих хронические воспалительные заболевания, а также числа больных с различными наследственными формами амилоидоза становится все более актуальной. Так указывают, что амилоидоз сердца обнаруживают у 2,3% умерших в возрасте до 50 лет, в возрастной группе 50-70 лет его выявляют у 30%, в группе 70-80 лет - уже у 41%, а у лиц, умерших в возрасте старше 90 лет, амилоидоз обнаруживали в 71-90% случаев [Козловская Л.В., Рамеев В.В., Саркисова И.А. Амилоидоз у пожилых // Клиническая медицина: Научно-практический журнал. - 2005. - Т. 83, N 6. - С. 12-20. - ISSN 0023-2149]. Более того, в настоящее время выясняется, что ряд заболеваний, патогенез которых ранее никак не связывали с амилоидогенезом, также реализуется через локальное отложение этого белка в тканях. Например, установлено, что причиной первичной открытоугольной глаукомы является отложение бета-амилоида и тау-белка не только в ганглионарные волокна сетчатки и аксоны зрительного нерва, но и проводящие пути зрительного анализатора вплоть до коры головного мозга [Chiu К., So K. - F., Chuen-Chung Chang R. Progressive Neurodegeneration of Retina in Alzheimer′s Disease - Are β-Amyloid Peptide and Tau New Pathological Factors in Glaucoma? // Glaucoma. Basic and Clinical Aspects. - 2013. Rumelt Sh. (Ed.), available from: http://www.intechopen.com/books/glaucoma-basic-and-clinical-aspects/progressive-neurodegeneration-of-retina-in-alzheimer-s-disease-are-amyloid-peptide-and-tau-nwe-patho].

Через накопление амилоидного белка реализуется патогенез целого ряда заболеваний: миозит с включениями [Kitazawa М., Green К.N., Caccamo A., La Ferla F.М. Genetically augmenting Abeta42 levels in skeletal muscle exacerbates inclusion body myositis-like pathology and motor deficits in transgenic mice // Amer. J. Pathol. - 2006. - V. 168, №6. - P. 1986-1997; Vattemi G., Nogalska A., King Engel W., D′Agostino C, Checler F., Askanas V. Amyloid-beta42 is preferentially accumulated in muscle fibers of patients with sporadic inclusion-body myositis // Acta Neuropathol. - 2009. - V. 117, №5. - P. 569-574.], деменция с тельцами Леви [Gomperts S.N., Rentz D.M., Moran E., Becker J.A., Locascio J.J., Klunk W.E., Mathis C.A., Elmaleh D.R., Shoup T., Fischman A.J., Hyman B.T., Growdon J. H. Johnson К.A. Imaging amyloid deposition in Lewy body diseases // Neurology. - 2008. - V. 71, №12. - P. 903-910], синдромы Альцгеймера [Irvine G.В., El Agnaf О.M., Shankar G.M, Walsh D.M. Protein aggregation in the brain: the molecular basis for Alzheimer′s and Parkinson′s diseases // Molecular Medicine. - 2008. - Vol. 14. - P. 451-464] и Дауна [Head E., Lott I.T. Down syndrome and beta-amyloid deposition // Current Opinion Neurology. - 2004. - V. 17, №2. - P. 95-100] и еще около 30 различных заболеваний [Luheshi L.V., Dobson С.M. Bridging the gap: from protein misfolding to protein misfolding diseases // FEBS Lett. - 2009. - Vol. 583. - P. 2581-2586]. Проведенный анализ исторических и современных литературных данных позволил сделать вывод, что исчерпывающих представлений об этиологии и патогенезе этого заболевания нет, а различные формы амилоидоза могут быть вызваны разными методическими приемами. В связи с этим, разработка новых моделей амилоидоза имеет не только прикладное, но и теоретическое значение. Новые модели амилоидоза необходимы для расширения научных представлений о патогенезе этого процесса, разработки методов профилактики и лечения. Известен способ моделирования экспериментального амилоидоза (Cohen A.S., Shirahama Т. Animal model for human disease: spontaneous and induced amyloidosis // Am. J. Pathol. - 1972. - Vol. 68, N 2. - P. 441-444; Грицман А.Ю. Некоторые вопросы экспериментальной терапии амилоидоза и резорбции амилоида: автореф. дисс. … канд. мед. наук / А.Ю. Грицман; М., 1974. - 24 с.), заключающийся в введении белым мышам через день по 0,5 мл 5%-ного казеината натрия в 0,05 М р-ре NaOH подкожно в течение 60 дней. Недостатком его является то, что приготовление раствора казеината связано с определенными сложностями, такими как поиск чистого казеина, необходимость растворения его точной навески в кипящем 0,25%-ном растворе гидроокиси натрия, фильтрование, стерилизация, хранение. Готовый раствор казеината натрия имеет щелочную реакцию, высокое содержание натрия, что резко ограничивает применение данной модели при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей, связанных с влиянием натрия и его определением.

Кроме того, известны патенты на экспериментальные модели амилоидоза и способы лечения экспериментального амилоидоза с помощью фармакологических препаратов RU 2270672 (51) МПК А61К 31/15; А61Р 13/12; RU 2306617 (51) МПК G09B 23/28; RU 2347279 (51) MIIK G09B 23/28; RU 2373581 (51) МПК G09B 23/28; RU 2446482 (51) МПК G09B 23/28; RU 2473133 (51) МПК G09B 23/28; А61К 31/502; А61Р 13/12; RU 2473134 (51) МПК G09B 23/28, в качестве амилоидогена в которых в основном используется альбумин, как основной белок плазмы крови, которую авторы получали как

от животных (свиньи), так и от человека, а также яичный альбумин, в том числе в сочетании с адъювантом Фрейнда.

Все известные способы получения экспериментального системного амилоидоза предполагают в качестве экспериментальных животных использование старых крыс, так как именно старческая брадитрофия тканей позволяет ставить вопрос о моделировании амилоидоза. На молодых крысах амилоидоз с использованием известных способов не воспроизводится из-за особенностей обмена веществ. Однако использование старых животных не позволяет проводить долгосрочный фармакологический эксперимент по лечению и профилактике амилоидоза. Продолжительность пребывания старых животных в каком-либо эксперименте резко ограничена преклонным возрастом.

Прототипом заявляемого изобретения является способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных (патент РФ на изобретение №2269825, Заалишвили Т. В., Козырев К. М., заявка №2004127649/14 от 15.09.04 г., МПК G09B 23/28), заключающийся во введении белым мышам через день по 1 мл нативного яичного альбумина подкожно через день из расчета на среднюю массу белых мышей самцов в возрасте 5-6 мес. - 23,3 г (0,05 мл/г массы тела) в течение 30 дней с соблюдением асептики. Нативный яичный альбумин извлекается из куриного яйца одноразовым шприцом без иглы после предварительной обработки 70% этиловым спиртом скорлупы и ее частичного снятия стерильным пинцетом. При таком способе моделирования амилоидоза получают модель с преимущественным поражением почек.

Недостатком такого способа является то, что не удается получить модель амилоидоза со значительным поражением селезенки, которую в дальнейшем можно было бы использовать для изучения и апробации новых методов лечения именно такой формы заболевания. Кроме того, известным способом получают модель амилоидоза на старых крысах, которых невозможно в дальнейшем использовать для долгосрочных фармакологических экспериментов по лечению и профилактике амилоидоза

Заявляемое изобретение решает задачу создания модели системного амилоидоза с преимущественным поражением селезенки на молодых животных с целью дальнейшего использования их в каких-либо экспериментах, например, при апробации различных способов лечения амилоидоза, а также расширение возможных средств для создания моделей амилоидоза.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание модели системного амилоидоза с преимущественным повреждением селезенки, а также возможность создания модели на молодых животных.

Этот технический результат достигается тем, что при моделировании экспериментального амилоидоза у животных, включающем введение молодой мыши через день подкожно в течение 30 дней эксперимента белкового препарата, содержащего нативный яичный альбумин, при этом в качестве белкового препарата, содержащего нативный яичный альбумин, вводят 30% раствор нативного яичного альбумина в цельном обезжиренном молоке по 0,5 мл.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом. Нативный яичный альбумин извлекают из куриного яйца и пропускают через мелкое сито для удаления пленок. После этого 30 мл яичного альбумина размешиваются в 70 мл цельного обезжиренного молока до гомогенной взвеси, которая делится на разовые порции и замораживается для последующего использования при -20°C. Порции размораживали непосредственно перед использованием. Цельное коровье молоко представляет собой естественный раствор казеина, в котором казеин содержится в нативной форме в количестве от 2,8 до 3,5% (Черников М.П. Протеолиз и биологическая ценность белков. Казеины как собственно пищевые белки. - М.: Медицина, 1975. - 231 с.), что существенно отличается от использования растворов казеина в NaOH. Существенным недостатком применения раствора казеина в NaOH является то обстоятельство, что NaOH значительно раздражает болевые рецепторы, поэтому предлагаемая модель является более соответствующей Принципам надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009), существенным требованием которой является возможно меньшая дополнительная травматизация подопытных животных. Кроме того, заявляемый способ позволяет получить амилоидоз у молодых мышей двухмесячного возраста. Данное обстоятельство позволяет проводить долгосрочный фармакологический эксперимент по лечению и профилактике амилоидоза,

Таким образом, совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

Сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, поскольку из него не выявлена описанная выше возможность получения модели экспериментального амилоидоза у молодых животных, заключающаяся во введении белкового препарата подкожно, в качестве которого молодым белым мышам через день вводят смесь 30% нативного яичного альбумина в цельном обезжиренном молоке по 0,5 мл в течение 30 дней эксперимента, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность предлагаемого изобретения, может быть многократно использована в экспериментальной биологии и медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе моделирования экспериментального амилоидоза у молодых животных, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

По истечении времени эксперимента (дней) животных декапитировали. Органы: печень, левая почка, селезенка - изъяты, измерены миллиметровой лентой, взвешены на электронных аналитических весах и зафиксированы 10% нейтральным формалином. После формалиновой фиксации органы были отмыты проточной водой, проведены через батарею спиртов восходящей крепости для обезвоживания и залиты парафином.

Из парафиновых заливок были приготовлены срезы толщиной 10 мкм, которые монтировали на предметных стеклах, после чего депарафинировали и окрашивали 1% раствором красного конго для выявления амилоида и докрашивали гематоксилином. Срезы микроскопировали в проходящем свете на микроскопе Лейка с последующей видеофиксацией микрофотографией в цифровом виде, а также на поляризационном микроскопе МИН-8.

Для технологического контроля постановки реакции на конго-красный и исключения ложноположительных результатов совместно с экспериментальными срезами в одной партии окрашивался препарат почки человека, больного почечным амилоидозом, препараты №0697,0698 (на всех фото приведены эталонные линейки).

Пример

Проведена серия опытов из двух групп:

Первая группа - интактные животные, содержавшиеся с подопытными в одной клетке в течение всех 30-ти дней эксперимента для обеспечения однородности условий содержания животных (5 белых молодых мышей).

Вторая группа - подопытные животные (5 белых молодых мышей), которым через день в течение 30-ти суток подкожно вводили смесь 30% яичного альбумина в цельном обезжиренном молоке через день, по 0,5 мл.

Необходимое минимальное количество животных определяли согласно Принципам надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009).

Полученный морфологический материал предварительно был подвергнут макроморфологическому исследованию. В интактной группе при дневном освещении форма, линейные размеры, цвет и консистенция органов животных были в пределах возрастной нормы, каких-либо патологических изменений, вызванных болезнями лабораторных животных, не выявлено. Капсула почки снимается легко. Данные о влажной массе изъятых органов представлены в таблице.

В подопытной группе при дневном освещении визуально форма, линейные размеры и цвет печени животных этой группы не отличались от интактных, однако консистенция печени была более плотная, чем у интактных мышей, на срезе печень выглядела как сальная. Внешних различий формы, консистенции, цвета и линейных размеров почек в этой группе не наблюдалось. Капсула почки снимается легко.

Селезенка была резко увеличена во всех размерах до 2,0±0,1 см в длину, 0,4±0,1 см в ширину и толщину в направлении от широкой части к селезеночной связке, в контроле 1,5±0,1?0,3±0,1?0,1±0,05 см, соответственно, консистенция плотная. Данные о влажной массе изъятых органов представлены в таблице. Другие органы визуально не изменены.

Примечание: значения р приведены по отношению к интактной труппе. Различия групп определены с помощью z-теста.

Для выявления амилоидоза красным конго окрашивали парафиновые срезы почек, селезенки и печени подопытных животных с последующим докрашиванием гематоксилином параллельно с парафиновыми срезами почки человека с клинически установленным диагнозом амилоидоз почки, обезличенные препараты почки были предоставлены республиканским бюро судебно-медицинской экспертизы Чувашской Республики. После того как окрашенные красным конго срезы почки человека были подвергнуты световой микроскопии, в процессе которой наблюдалась классическая гистологическая картина почечного амилоидоза при окраске конго, световой микроскопии были подвергнуты срезы экспериментальных животных. У животных контрольной группы наблюдалась следующая гистологическая картина:

1. Почка (рис. 1): на срезах толщиной 5 мкм почки диаметр клубочка составлял около 50-70 мкм. Нефротелий был представлен клетками, приближающимися к кубическому эпителию с округлыми ядрами и цитоплазмой, прокрашивающейся в кирпичный цвет. По количеству ядер в петлях капилляров клубочка определялось от 45 до 60 клеток и примерно столько же эритроцитов. Наблюдается картина нефрита.

Канальцевый эпителий не имел морфологических отклонений и соответствовал гистологической норме.

2. Селезенка (рис. 2): большая часть препаратов представлена белой пульпой, состоящей из лимфоидных фолликулов. Красная пульпа представлена ретикулярной стромой и эритроцитами. Морфологический паттерн соответствует гистологической норме.

3. Печень (рис. 3): паренхима печени имела вид булыжной мостовой (вымывание гликогена в процессе подготовки срезов к окраске) - нормальная гистологическая картина. Цитоплазма клеток светооптически пустая, содержала мелкие зерна. Морфологический паттерн соответствует гистологической норме.

У животных подопытной группы гистологическая картина соответствовала наличию амилоидоза:

1. Почка (рис. 4): диаметр клубочков составлял 50-80 мкм. Нефротелий представлен плоским, а иногда кубическим эпителием. Количество клеток, содержащих ядра, в капиллярах клубочков от 20 до 40. Отдельные сегменты клубочка представлены гомогенными конго-положительными депозитами (показано стрелкой), не содержащими ядер, которые сдавливали петли капилляров, о чем свидетельствуют ядра овальной или уплощенной формы. Выявлялись единичные эритроциты. Просветы канальцев несколько сужены, имели фестончатое строение, содержали зернистые массы. Цитоплазма канальцевого эпителия была мелкозернистая, со слабой конго-положительной реакцией.

2. Селезенка. Препараты (рис. 5, 6): лимфоидные фолликулы селезенки либо циркулярно окружены амилоидом (показано стрелкой - А), во многих фолликулах лимфоидная ткань замещена амилоидом с разной степенью выраженности (показано стрелкой - Б). Красная пульпа практически отсутствует. Препараты (рис. 7, 8): отмечается присутствие большого количества мегакариоцитов на разных стадиях формирования. Препараты (рис. 9, 10): выявляются единичные указанные клетки с патологическими митозами, заключающимися в дехроматизации и рассеянии ядерного материала на два полюса клетки неравномерно (показано стрелкой).

3. Печень. Препараты рис. 11, 12, 13: цитоплазма гепатоцитов при окраске конго красным мелко вакуолизирована. Амилоид-положительное вещество выявлялось только в строме портальных трактов и стенках сосудов.

4. Таким образом, в результате проведенного исследования получены гистоморфологические доказательства эффективности применения смеси 30% нативного яичного альбумина в цельном обезжиренном молоке для моделирования системного экспериментального амилоидоза у животных. Преимущественно поражаемым органом в данной модели системного амилоидоза является селезенка.