27.03.2015
216.013.367d

Способ моделирования атеросклероза

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к экспериментальной медицине, патофизиологии и может быть использовано при изучении атеросклеротического процесса. Для этого проводят моделирование атеросклероза путем кормления исследуемых животных атерогенным рационом. В качестве атерогенного рациона в течение 12 месяцев у крыс используют питьевую воду, свеклу, морковь, картофель и зерно пшеницы из Присурского субрегиона Чувашской республики, неблагополучного в отношении распространенности атеросклероза, ишемической болезни сердца, смертности от острого инфаркта миокарда. Способ обеспечивает создание модели атеросклероза, максимально приближенной к естественным условиям среды проживания людей, что позволяет выявлять специфические механизмы патогенеза и разрабатывать эффективные мероприятия первичной профилактики заболевания. 4 табл., 8 ил.
Основные результаты: Способ моделирования атеросклероза, включающий кормление исследуемых животных атерогенным рационом, отличающийся тем, что в качестве атерогенного рациона в течение 12 месяцев у крыс используют питьевую воду, свеклу, морковь, картофель и зерно пшеницы из Присурского субрегиона Чувашской республики, известного в соответствии со статистическими данными как неблагополучный субрегион в отношении распространенности атеросклероза, ишемической болезни сердца, смертности от острого инфаркта миокарда.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к экспериментальной медицине, патофизиологии и может быть использовано в целях диагностики, профилактики и лечения атеросклеротического процесса.

Экспериментальные исследования составляют неотъемлемую часть биологических и медицинских исследований. Экспериментальные модели болезней человека широко используются для изучения механизмов формирования и развития патологии, выяснения роли экзогенных и эндогенных факторов в становлении патологических процессов, дают возможность изучить патогенез на тканевом и клеточном уровне, изыскать новые средства лечения и профилактики.

Известно создание моделей инфаркта миокарда на животных (Патент RU №2243595, МПК G09B 23/28, опубл. 27.12.2004 г.; Патент RU №2286606, МПК G09B 23/28, опубл. 27.10.2006 г.). Однако известные способы моделирования инфаркта миокарда являются инвазивными, травматичными, не обеспечивают раскрытие причинно-следственных связей возникновения заболевания.

В современной медицине доминирует экологическая модель происхождения болезней, в соответствии с которой болезни возникают вследствие действия на организм разнообразных факторов внешней среды, главным образом питьевой воды и пищи. Например, экспериментальными исследованиями была доказана связь между дефицитом магния в диете и атеросклеротическими изменениями в сосудах, функциональными нарушениями сердечного ритма (Lasserre В., Durlach J. Magnesium a Relevantion. - 1994. - Vol.4. - P.411-421.). Полученные данные показывают, что баланс минерального обмена, обусловленный соотношением K/Na и Mg/Ca, должен рассматриваться как важный фактор, оказывающий влияние на инфарктоидные повреждения сердечной мышцы. Но в современном понимании этиопатогенеза хронических неинфекционных заболеваний и их последствий необходимо учитывать установленные ранее корреляционные связи атеросклероза и его последствий с макро- и микроэлементами почв, питьевых вод и суточных рационов питания. Для доказательства их пусковой, причинной роли в процессе «здоровье↔атеросклероз» необходимо изучение причинно-следственных связей в условиях экспериментального моделирования.

Известен способ моделирования атеросклероза (патент RU №2500041, МПК G09B 23/28, опубликовано 27.11.2013 г.), при котором лабораторным животным - крысам добавляют в корм порошок холестерина в количестве 1%, маргарин 10%, мерказолил 10 мг/кг и витамин D - 2,5 ME на кг массы тела. Дополнительно животным проводят операцию, состоящую из наложения лигатуры на почечную ножку левой почки нерассасывающимся шовным материалом и прошивания верхнего полюса правой почки, оставляя 2/3 органа. Однако известный способ является инвазивным, не отражает механизмы развития атеросклероза в естественных условиях.

Задачей изобретения является создание экспериментальной модели атеросклероза, наиболее точно отражающей связь этиопатогенеза атеросклероза и его последствий со средовыми факторами.

Техническим результатом является создание модели атеросклероза у животных, например крыс, максимально приближенной к экологической модели атеросклероза, развивающейся у людей, длительно проживающих в конкретном субрегионе.

Технический результат достигается тем, что моделирование осуществляют кормлением животных (крыс) опытной группы водно-пищевым рационом среды обитания людей, длительно проживающих в зоне эколого-биогеохимического бедствия, статистически неблагополучным в отношении распространенности атеросклероза, ишемической болезни сердца и смертности от острого инфаркта миокарда (Присурский субрегион Чувашской республики). Для кормления животных контрольной группы использовали продукты питания, привезенные из зоны эколого-биогеохимического оптимума, который отличается более низкими показателями распространенности атеросклероза и его последствий среди постоянно проживающего населения (Прикубниноцивильский субрегион Чувашской республики). (Сусликов В.Л. Эколого-биогеохимическое районирование территорий - методологическая основа для оценки среды обитания и здоровья населения. - Чебоксары. ЧГУ. 2001. - 40 с.).

В эксперименте были использованы беспородные крысы-самцы с начальной массой 131,0±12,0 г. Крыс разделили на две группы. Пятнадцать животных получали питьевую воду из эколого-биогеохимической зоны бедствия (колодец с. Кудеиха Порецкого района ЧР), пятнадцать животных контрольной группы получали питьевую воду из зоны оптимума (колодец с. Тюмерево Янтиковского района). В качестве корма использовали овощи (свеклу, морковь, картофель) и зерно пшеницы. Кормление крыс осуществлялось по нормам, утвержденным для лабораторных животных МЗ РФ.

Уровень содержания микроэлементов в питьевых водах и кормах определяли методом прямой атомно-абсорбционной спектрометрии. (Ермаченко Л.А, Атомно-абсорбционный анализ в санитарно-гигиенических исследованиях: Методическое пособие. - Чеб. ЧГУ. 1997. - 220 с.). Метод основан на способности микроэлементов поглощать ультрафиолетовые лучи длиной волны 285-295 нм после осаждения белков пробы с помощью терморегуляции. Для каждого определяемого элемента использовали источник резонансного излучения, определяемый элемент переводили в элементарное состояние с помощью атомизации (t - 2000-3000°C), для получения количественного результата проводили серию предварительных измерений, по которым строили градуировочный график. Предварительно проводили пробоподготовку методом автоклавной минерализации в автоклаве «АНКОН-АТ-2». Метод основан на полной минерализации пробы смесью азотной кислоты и пероксида водорода в реакционной камере автоклава. Полученные пробы взвешиваются с точностью до 1 мг, помещаются в стерильные пробирки и хранятся при температуре - 18°C. Для исследования микроэлементов использовали атомно-абсорбционный спектрометр «Квант - Z. ЭТА». Преимуществами данного метода являются высокая чувствительность и избирательность, невысокая вероятность совпадения спектральных линий разных элементов, соответственно более высокая селективность определений. Определение количества йода и фтора проводили ионоселективным методом с применением прибора «Эксперт-1», предназначенного для измерения активности (PX, Ph), массовой концентрации ионов (C), (E) - окислительно-восстановительного потенциала. Измерение величины производилось потенциометрическим методом при помощи ионоселективных электродов, который заключается в измерении разности потенциалов электродвижущей силы измерительного электрода и электрода сравнения. Для анализа брали не менее 100 мл воды исследуемых территорий. Химический состав воды оценивали трехкратно в течение эксперимента (осень, зима, весна). Определение хлоридов, сульфатов, общей жесткости воды осуществляли титрометрическим методом. Изучение полостной и пристеночной микрофлоры всех отделов толстого и тонкого кишечника методом посева на специально приготовленные среды.

Забор крови у крыс проводили из хвостовой вены, путем обрезания кончика хвоста (Георгиева С.А., Беликина Н.В. Физиология. - М.: Медицина. 1981. - С.191-192; Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные. Киев. 1974. С.204-209). Выделение микроорганизмов осуществляли в соответствии с «Методическими рекомендациями по диагностике и лечению дисбактериоза кишечника» (1986), разработанными в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского (Краткий определитель бактерий Берджи // Под ред. Д. Хоулта, Н. Крига, пер. с англ. под ред. чл.-корр. АН СССР Г.А. Заварзина. - М.: Мир. - 1997. - Т.1-2. - 800 с.). Идентификацию микроорганизмов проводили на основании «Определителя микроорганизмов Берджи» и «Справочника по микробиологическим и вирусологическим методам исследования» на стандартных дифференциально-диагностических средах с помощью «Систем индикаторных бумажных», выпускаемых Нижегородским научно-исследовательским институтом микробиологии и эпидемиологии (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования // Под ред. Бигера М.О. - М.: Медицина. - 1992. - 462 с.). Материал помещали в стерильный флакон. Для приготовления основного разведения (1:10) после взвешивания материала во флаконы добавляли недостающее количество фосфатного буферного раствора и тщательно встряхивали в течение не менее 5 минут до получения однородной массы фекалий. Для определения количества кишечных палочек и бактерий, относящихся к группе кишечной палочки в 1 г фекалий, производили посев из основного разведения на среду Эндо и на кровяной агар по методу Голда в модификации Ю.М. Фельдмана. Для выделения стафилококков материал засевали на желточно-солевой агар, бифидобактерий - на среду Блаурокка, лактобактерий - на стерильное молоко, условно-патогенных грибов - на среду Сабуро, других факультативно-анаэробных микроорганизмов - на шоколадный агар (Краткий определитель бактерий Берджи // Под ред. Д. Хоулта, Н. Крига, пер. с англ. под ред. чл.-корр. АН СССР Г.А. Заварзина. - М: Мир. - 1997. - Т.1-2. - 800 с.; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования // Под ред. Бигера М.О. - М: Медицина. - 1992. - 462 с.).

С целью выявления взаимосвязи между микроэлементным составом питьевых вод, кормов и возможностью развития атеросклеротических процессов в организме экспериментальных животных нами были определены эластазоподобная активность, активность α1-ПИ и α2-МГ в крови крыс. Кровь у животных брали из хвостовой артерии через 9 мес. после начала эксперимента. По окончании эксперимента крыс подвергали патологоанатомическому вскрытию под эфирным наркозом. Аорту, взятую на уровне дуги и бифуркации, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и заливали в парафин. Эластические волокна окрашивали резорцион-фуксином. В работе использовали нитрофениловый эфир N-бутилоксикарбонил L-аланина (БАНЭ), этиловый эфир N-бензоил-L-аргинина (БАЭЭ) фирмы "Reanal" (Венгрия), трипсин фирмы (Чехословакия). Эластазоподобную активность измеряли методом L. Visser (Нартикова В.Ф. Активность эластазоподобных протеаз. / В.Ф. Нартикова, T.C. Пасхина // Вопр. мед. химии. - 1979. Т.25. - С.494-500): к 0,06 мл сыворотки крови приливали 2,85 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера pH 6,5 и 0,1 мл 10-3М БАНЭ. Изменение оптической плотности определяли спектрофотометрически при 345,5 нм при 25°С против 3,3-10-5М раствора субстрата через 2-3 мин на 1 мл сыворотки крови. Активность эластазоподобных протеаз выражали в наномолях гидролизированного БАНЭ за 1 мин на 1 мл сыворотки крови.

Активность α1-ПИ и α2-МГ в сыворотке крови определяли методом В.Ф. Нартиковой, Т.С. Пасхиной (Нартикова В.Ф. Активность эластазоподобных протеаз. / В.Ф. Нартикова, Т.С. Пасхина // Вопр. мед. химии. - 1979. Т.25. - С.494-500) по торможению гидролиза БАЭЭ трипсином. Активность α1-ПИ и α2-МГ выражали в условных ингибиторных единицах (ИЕ).

Для наноскопических исследований использовались криостатные срезы аорты животных толщиной 15 мкм, которые изучались на приборе «Femtoscan» в режиме атомно-силовой микроскопии в программе «Femtoscan Onlaine».

Состояние липидного обмена у экспериментальных животных оценивали по результатам исследований общего холестерина, липопротеидов и триглицеридов по стандартизованной методике Центра профилактической медицины РАМН (г. Москва). Полученные результаты подвергались статистической обработке в пространстве Microsoft Excel XP; достоверность различий оценивали с помощью критерия Стьюдента при p<0,05.

В Таблице 1 приведены данные микроэлементного состава питьевых вод из колодцев эколого-биогеохимической зоны оптимума и эколого-биогеохимической зоны бедствия. Представленные данные указывают на наличие существенной разницы как в количественном содержании исследованных микроэлементов, так и в их соотношениях к йоду.

В Таблице 2 приведены данные микроэлементов в кормах, выращенных в эколого-биогеохимической зоне оптимума и в эколого-биогеохимической зоне бедствия. Представленные данные микроэлементного состава кормов указывают на наличие существенной разницы, как в количественном содержании исследованных микроэлементов, так и в их соотношениях к йоду.

В Таблице 3 приведены показатели уровней содержания холестерина и липопротеидов в сыворотке крови крыс контрольной и опытной групп через 6 месяцев и через 12 месяцев с начала эксперимента. Особый интерес представляют данные о закономерностях изменения липидного обмена, которые свидетельствуют о том, что эти изменения появляются позже по времени. Так, через 6 месяцев мы не обнаруживали изменений в уровнях содержания общего холестерина и липопротеидов в сыворотке крови как в контрольной, так и в опытной группе, но через 12 месяцев в крови у крыс опытной группы достоверно повысились уровни общего холестерина (ОХ), липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), снизились уровни липопротеидов высокой плотности (ЛПВП).

В Таблице 4 приведены показатели активности эластазоподобных протеаз и их ингибиторов в крови экспериментальных животных.

Данные протеиназно-ингибиторного баланса, полученные у экспериментальных животных, показывают, что у животных, употреблявших воду и корма из зоны эколого-биогеохимического бедствия, выявлен достоверно (p<0,01) более высокий уровень эластазоподобных протеаз в сыворотке крови по сравнению с животными, употреблявшими воду и корма из зоны эколого-биогеохимического оптимума. Активность α-ПИ оказалась достоверно сниженной (p<0,01), в то время как активность α1-МГ достоверно (p<0,01) повышенной у крыс из эколого-биогеохимической зоны бедствия по сравнению с контрольной группой крыс. Анализ эластазо-ингибиторного баланса крови у животных, употреблявших воду и корма с различными уровнями и соотношениями микроэлементов, показал, что степень компенсации протеиназно-ингибиторной системы крови контрольной группы выше, чем у опытной группы животных, т.к. соотношение активности α1-ПИ и активности эластазоподобных протеаз (ЭПП) в 2 раза выше. Патоморфологический анализ аорты, взятой у крыс, получавших воду и корм из зоны эколого-биогеохимического бедствия, обнаружил явления дезорганизации эластических волокон: во внутренней и средней части меди имелись фрагментация и распад на мелкие глыбки отдельных волокон с частичным расширением и деформацией промежутков между ними. Обнаруженные изменения в структуре эластических волокон характерны для начальной стадии атеросклероза. Морфологическая характеристика состояния аорты отражает степень функционирования практически всех систем организма и позволяет адекватно оценить степень флуктуации гомеостаза. Результаты проведенных наноскопических исследований срезов аорты экспериментальных крыс приведены на Рис.1а, Рис.1б, Рис.1в, Рис.1г, где на Рис.1а и Рис.1б приведены нанограммы контрольной и опытной групп крыс соответственно, а на Рис.1в и Рис.1г приведены трехмерные изображения срезов аорты контрольной и опытной групп крыс соответственно. На нанограмме аорты животных контрольной группы отчетливо видны «жгуты» из отдельных эластических волокон, причем каждое волокно состоит из большого числа секторов правильной квадратоподобной фрагментации с четким взаимопереплетением как отдельных волокон, так и «жгутов».

На Рис.2а и Рис.2б приведены изображения обработки периодических структур эластического каркаса аорты экспериментальных животных контрольной и опытной группы соответственно. В исследованиях аорты животных опытной группы (Рис.2б) наблюдается заметная расплывчатость контуров отдельных эластических волокон и их веретенообразность и отсутствие «взаимопереплетения». Указанные изображения, трансформированные методом статистического сложения, показывают организованность структур эластических волокон в контрольной группе животных (Рис.2а). Выделенный полезный сигнал у животных опытной группы подтверждает дезорганизацию эластического каркаса аорты (Рис.2б).

С целью выявления взаимосвязи между микроэлементным составом питьевых вод и кормов с качественным и количественным составом аутомикрофлоры кишечника экспериментальных животных были исследованы фоновые характеристики микрофлоры толстого кишечника. Исследования кала проводили через 5-6 месяцев и 9-10 месяцев от начала эксперимента. Динамика изменений количественного и видового состава аутомикрофлоры толстого кишечника контрольной группы и опытной группы животных представлена на Рис.3а и Рис 3б соответственно. Как видно из Рис.3а и Рис.3б, через 5-6 месяцев у животных из опытной и контрольной групп не произошло заметных изменений в количественном и качественном составе аутомикрофлоры толстого кишечника, в то время как через 9-10 месяцев у крыс в опытной группе обнаружилось достоверное (p<0,05) снижение количества кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью, бифидо- и лактобактерий, возросло количество Proteus mirabilis. Через 10 месяцев у крыс из опытной группы были обнаружены гемолитические стафилококки, отсутствующие у крыс из контрольной группы, в этот же период заметно возросло микробиологическое разнообразие в толстом кишечнике опытных животных за счет появления таких микроорганизмов, как Вас. Cereus, Staphilococcus epidermalis, Staphylococcus aurus и другие условно-патогенные микроорганизмы. Полученные данные убедительно свидетельствуют об участии микрофлоры толстого кишечника в регуляции липидного обмена. Данные о повышении уровня холестерина и липопротеидов полностью согласуются с материалами о существовании холестеринзависимых кишечных палочек (Панчишина М.В. Клинико-экспериментальные материалы об участии кишечной микрофлоры в обмене холестерина при некоторых внутренних заболеваниях: Автореф. докт. мед. наук. - Львов, 1987. - 47 с.). О том, что изменения в видовом составе могут происходить под влиянием аномально-нерегулируемых соотношений макро- и микроэлементов, из литературных данных ранее было неизвестно. Таким образом, заявленный способ моделирования атеросклероза позволяет получить экспериментальную модель атеросклероза, наиболее точно отражающую связь этиопатогенеза атеросклероза и его последствий со средовыми факторами. Принципиальной особенностью данного способа моделирования является то, что при данной модели атеросклероз рассматривается как природно-средовое явление.

Заявленный способ моделирования атеросклероза отличается от известного способа тем, что водно-кормовой режим животных максимально приближен к естественным условиям питания населения, проживающего на определенной территории. Донозологические сдвиги развиваются постепенно к концу эксперимента, что позволяет детально оценить нарушения липидного и минерального обмена, гормонального статуса, нарушений микробиоценоза. Заявленный способ моделирования несложен в техническом отношении и достаточно точно отражает предпатологические сдвиги в организме животных, позволяет получить модель атеросклероза, максимально приближенную к экологической модели атеросклероза, развивающейся у людей, проживающих на территориях с различными средовыми факторами, что в дальнейшем позволит разработать научные рекомендации по первичной профилактике атеросклероза, проводить изыскание новых средств лечения и профилактики с учетом средовых факторов.

Таблица 1
Микроэлементы (мг/л) ЭБ зона бедствия
Кол-во / соотношение к йоду (мг/л)
ЭБ зона оптимума
Кол-во / соотношение к йоду (мг/л)
Йод 0,01/1 0,01/1
Железо 0,6/60,0 0,7/70,0
Фтор 1,3/130,0 0,7/70,0
Кальций 86,0/8600,0 110,0/1100,0
Магний 9,0/900,0 32,0/3200,0
Стронций 0,7/70,0 0,36/36,0
Натрий 46,0/4600,0 4,0/400,0
Калий 6,7/670,0 1,0/100,0
Литий 0,0095/0,95 0,0085/0,85
Цинк 0,06/6,0 0,04/4,0
Свинец 0,06/6,0 0,03/3,0
Кобальт 0,06/6,0 0,2/2,0
Медь 0,07/7,0 0,06/6,0
Кадмий 0,07/7,0 0,04/4,0
Никель 0,07/7,0 0,04/4,0
Хром 0,6/60,0 1,0/100,0
Кремний 14,6/1460,0 3,0/300,0
Барий 6,0/600,0 60,0/6000,0

Таблица 2
Микроэлементы Зона оптимума Соотношение к йоду Зона Бедствия Соотношение к йоду
Медь (Cu), мг/кг 0,81 0,12 0,97 0,14
молибден (Mo), мг/кг 0,031 0,004 0,041 0,058
Кадмий (Cd), мг/кг 0,01276 0,00181 0,01434 0,14030
кобальт (Co), мг/кг 0,02387 0,00339 0,03789 0,00531
кремний (Si), мг/кг 30,01 4,26 35,53 4,98
Йод (I), мкг/кг 7,05 1 7,13 1
Фтор (F), мг/кг 2,10 0,29 2,80 0,39
селен (Se), мг/кг 0,111 0,016 0,072 0,011

Таблица 3
Показатели, ммоль/л Через 6 месяцев
Контрольная Опытная
Через 12 месяцев
Контрольная Опытная
Холестерин (10)1,51+0,08 (9)1,52+0,10 (9)1,49+0,12 (9)1,85+0,11*
ЛПОНП (10)0,45+0,21 (9)0,48+0,12 (9)0,48+0,11 (9)0,62+0,06*
ЛПНП (10)0,94+0,33 (9)0,95+0,41 (9)1,04+0,20 (9)1,58+0,17*
ЛПВП (10)2,46+0,22 (9)2,51+0,25 (9)2,55+0,31 (9)1,77+0,47*

Таблица 4
п/п Показатели активности эластазо-ингибиторного баланса Опытная группа Контрольная группа
n M±m n M±m
1 Эластазоподобные протеазы (ЭПП) (нмоль/мин/мл) 10 2137±6* 7 1558±8
2 Ингибитор (ИЕ/мл) 10 6,31±0,3* 7 7,98±0,2
3 Ингибитор (ИЕ/мл) 10 1,06±0,1* 7 0,83±0,02
4 Величина 0,03 0,06
Примечание: * - p<0,01

Способ моделирования атеросклероза, включающий кормление исследуемых животных атерогенным рационом, отличающийся тем, что в качестве атерогенного рациона в течение 12 месяцев у крыс используют питьевую воду, свеклу, морковь, картофель и зерно пшеницы из Присурского субрегиона Чувашской республики, известного в соответствии со статистическими данными как неблагополучный субрегион в отношении распространенности атеросклероза, ишемической болезни сердца, смертности от острого инфаркта миокарда.
Способ моделирования атеросклероза
Способ моделирования атеросклероза
Способ моделирования атеросклероза
Способ моделирования атеросклероза
Способ моделирования атеросклероза
Способ моделирования атеросклероза
Способ моделирования атеросклероза
Способ моделирования атеросклероза
Источник поступления информации: Роспатент

Всего документов: 86
Всего документов: 91

Похожие РИД в системе

Защитите авторские права с едрид