Результат интеллектуальной деятельности: ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ЗОНД ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК ВИРУСА ОСПЫ СВИНЕЙ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Вирус оспы свиней - это единственный представитель рода Suipoxvirus, одного из 8 родов в подсемействе Chordopoxvirinae семейства Poxviridae. Оспа свиней - повсеместно распространенная контагиозная болезнь, протекающая с признаками интоксикации, лихородки, узелково-папулезной сыпи на коже и слизистой оболочке. Наиболее тяжело болезнь протекает у поросят (до 4 месяцев), заболеваемость среди которых может достигать 100% [8].

Источник возбудителя - больные животные, выделяющие вирус с оспенными корочками, со слюной, истечениями из глаз и носа. В организм животных вирус проникает респираторным путем, через кожу и слизистые оболочки, через пищеварительный тракт. Факторы передачи возбудителя - объекты внешней среды (особенно трупы погибших животных, кожа, шкуры), контаминированные возбудителем. Механическими переносчиками оспенных вирусов могут быть грызуны, москиты, накожные паразиты, в частности свиная вошь Haematopinus suis, у которой они могут сохраняться до года и более. Вспышки заболевания встречаются в течение круглого года, но чаще возникают и тяжелее протекают зимой и весной. Болезнь быстро охватывает до 80% поголовья, но у каждого животного она протекает сравнительно медленно - в течение 20-60 дней [1, 2, 5, 6].

Оспу свиней также могут вызывать представители рода Orthopoxvirus - вирусы оспы коров и осповакцины. Тем не менее свиньи, переболевшие оспой, вызванной вирусом оспы свиней, сохраняют восприимчивость к вирусам оспы коров и осповакцины, и наоборот [1]. Поэтому возникает необходимость в четкой идентификации вируса, вызвавшего болезнь у свиней. В настоящее время наиболее быстрым и специфичным методом идентификации возбудителей вирусных инфекций является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В России и за рубежом разработано большое количество тест-систем на основе молекулярно-генетических методов для диагностики инфекций, вызываемых поксвирусами, в том числе и вирусом коровьей оспы [3, 4, 7]. В то же время тест-системы на основе ПЦР для идентификации вируса оспы свиней не разработаны.

Целью данного изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для выявления ДНК вируса оспы свиней в различных образцах биоматериала методом ПЦР в реальном времени.

Изобретение представляет собой олигонуклеотидные праймеры SPVU и SPVD и флуоресцентно-меченый зонд SPVZ, характеризующиеся тем, что они комплементарны фрагменту гена ингибитора протеинкиназы (SPV032) вируса оспы свиней. Нуклеотидный состав используемых праймеров и зонда следующий:

SPVU - 5' - gta сса ttt tgg agg аса eg - 3'

SPVD - 5' - ttc aat aaa tcg cca gtt gta с - 3'

SPVZ - 5'- [FAM] ggt acc ata tct ata tat ccc tgt tg [BHQ₁] - 3'

Техническим результатом изобретения является повышение степени специфичности и чувствительности, а также сокращение времени проведения диагностической работы по обнаружению ДНК вируса оспы свиней в пробах исследуемого биоматериала (смывы с ротовой и носовой полостей, суспензии струпьев от больных свиней, культуры клеток).

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных праймеров (SPVU и SPVD) и зонда (SPVZ) проводят ПЦР в реальном времени, позволяющую выявить ДНК вируса оспы свиней. При наличии в исследуемых образцах ДНК вируса оспы свиней в ходе ПЦР синтезируется фрагмент ДНК размером 79 пар оснований.

Детекция продуктов амплификации осуществляется методом регистрации флуоресценции, генерируемой в результате разрушения гибридизационного зонда, содержащего на 5'-конце флуорофор FAM, а на 3'-конце - гаситель BHQ₁. В отсутствие мишени флуорофор и гаситель сближены, и наблюдается лишь незначительная флуоресценция, так как гаситель поглощает испускаемое флуорофором излучение. При накоплении в ходе ПЦР специфических продуктов зонд гибридизуется на ампликон, что ведет к его разрушению за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы. В результате флуорофор отделяется от гасителя и его излучение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флуоресценции прямо пропорционально количеству синтезированного ПЦР-продукта.

Существенным отличием данных праймеров и зонда является то, что они комплементарны консервативной области гена ингибитора протеинкиназы (SPV032) вируса оспы свиней и не комплементарны каким-либо участкам геномов других вирусов.

Изобретение иллюстрируется несколькими примерами.

Пример 1. Амплификация фрагмента ДНК вируса оспы свиней.

Расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зонда.

С помощью программы "Bio Edit 7.0" выравнены доступные в базе данных GenBank нуклеотидные последовательности геномов вирусов оспы свиней (AF410153.1), нодулярного дерматита (AF409138.1, AF325528.1), осповакцины (М14783.1, DQ121394.1, EU410304.1), оспы коров (КС813512.1, AF482758.2, КС813511.1), оспы овец (AY077832.1, AY077834.1, AY077833.1) и оспы коз (AY077836.1, AY077835.1). В результате проведенного анализа в качестве мишени для амплификации в полимеразной цепной реакции выбран ген ингибитора протеинкиназы (SPV032) вируса оспы свиней.

С помощью программы "Oligo 6.0" рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченый зонд, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров SPVU и SPVD (нуклеотидные позиции 5'→3':25709-25787).

ПЦР в реальном времени проводили на детектирующем амплификаторе "Rotor Gene 6000" (Corbett Research, Австралия). Температурный режим для проведения ПЦР включает следующие этапы: 2 мин предварительной денатурации при 94°C и 40 циклов амплификации (94°C - 10 с, 60°C - 15 с). Измерение флуоресценции проводили при температуре 60°C по каналу "Green" (FAM). Результаты ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения амплификатора.

Результаты интерпретировали на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,02 пороговой линией (Threshold). Образец считали положительным на наличие ДНК вируса оспы свиней, если кривая флуоресценции пересекала пороговую линию не позднее 35 цикла амплификации.

Пример 2. Определение специфичности ПЦР в реальном времени.

ДНК из исследуемого материала выделяли с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК, входящего в состав набора «Тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР» (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).

Для оценки специфичности ПЦР в реальном времени исследовали препараты ДНК, выделенной из образцов культурального материала, содержащего вирусы оспы свиней, оспы коров, осповакцины, оспы овец, оспы коз, бугорчатки КРС, интактной культуры клеток РК-15 и из смывов с ротовой полости интактной свиньи. При этом положительный результат получен только при исследовании ДНК, выделенной из образца, содержащего вирус оспы свиней, что свидетельствует о специфичности разработанных праймеров и зонда.

Результаты ПЦР в реальном времени

Пример 3. Определение аналитической чувствительности ПЦР в реальном времени.

Аналитическую чувствительность метода определяли с использованием рекомбинантной плазмиды, содержащей амплифицируемый фрагмент геномной ДНК вируса оспы свиней. Спектрофотометрически измеренная концентрация плазмиды составила 305,5 нг/мкл, что соответствует 0,923*10¹⁰ копиям ДНК в 1 мкл.

Десятикратные разведения (в трех повторах) данной плазмиды использовали для определения аналитической чувствительности ПЦР в реальном времени. Пределом чувствительности считали максимальное разведение, при котором регистрировали положительный результат. Рассчитанное значение аналитической чувствительности метода ПЦР в реальном времени составило 9 копий ДНК/мкл, что соответствует 45 копиям ДНК в реакционной смеси.

Источники информации

1. В.Н. Сюрин. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. - Москва, ВНИТИБП. - 1998. - 928 с.

2. Cheville, N.F. The cytopathology of swine pox in the skin of swine / N.F. Cheville // Am. J. Pathol. - 1996. - Vol.49. - P. 339-352.

3. Cowpox virus in a 12-year-old boy: rapid identification by an orthopoxvirus-specific polymerase chain reaction / Р. Schupp [et. al] // Br. J. Dermatol. - 2001. - Vol.145. - P. 146-150.

4. Development of real-time PCR assay for specific detection of cowpox virus / E.V. Gavrilova [et. al] // J. Clin. Virol. - 2010. - Vol.49. - №1. - P. 37-40.

5. House, J.A. Swine pox / J.A. House, C.A. House // Diseases of swine, 7th ed. - Iowa State University Press, Ames. - 1994. - P. 358-361.

6. Munz, E. Swinepox / E. Munz, K. Dumbell // Infectious diseases of livestock, vol.1. Oxford University Press, New York, N.Y. - 1994. - P. 627-629.

7. Real-Time PCR system for detection of orthopoxviruses and simultaneous identification of smallpox virus / V.A. Olson [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2004. - V.42. - P. 1940-1946.

8. The genome of swinepox virus / E.R. Afonso [et al.] // J. of Virology. - 2002. - Vol.76. - №2. - P. 783-790.