ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ, ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ЗОНД И СПОСОБ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА БОЛЕЗНИ ИБАРАКИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Болезнь Ибараки (БИ) - трансмиссивная неконтагиозная болезнь парнокопытных жвачных вирусной этиологии, характеризующаяся в острой форме лихорадкой, анорексией, язвенным поражением ротовой полости и нарушением глотательного рефлекса. В некоторых случаях возбудитель инфекции - вирус болезни Ибараки (ВБИ) - влияет и на репродуктивную функцию, вызывая абортирование плодов и мертворождение.

Наиболее часто БИ регистрируют среди КРС. Однако доказана слабая патогенность возбудителя инфекции для овец, которые являются скрытыми вирусоносителями.

Инкубационный период при БИ составляет 4-12 дней. Затем наблюдают внезапное повышение температуры тела до 40°С, продолжающееся 2-3, реже 7-10 дней. У животных развиваются такие клинические признаки болезни как: общее угнетение, отсутствие или снижение аппетита, лейкопения, слезотечение, пенистое слюнотечение, гиперемия и отек конъюнктивы, слизистой оболочки носа и ротовой полости. Большинство животных выздоравливают через 2-3 дня, однако у некоторых течение болезни осложняется развитием некрозов, эрозий и язв на коже лицевой части головы, слизистой оболочке рта, носа, желудка и венчике копыт. У 20-30% животных через 7-10 дней после начала болезни появляется характерный симптом - затрудненное глотание, а также наблюдается выпячивание языка. Данные нарушения возникают вследствие паралича мышц языка, гортани, глотки, пищевода и приводят к обезвоживанию и истощению организма при отсутствии дефицита корма. Кроме того, течение болезни может сопровождаться появлением аспирационной пневмонии и нарушением репродуктивной функции.

Летальность у КРС при данном заболевании варьирует в пределах 5-10%, а при развитии такого симптома болезни как затрудненное глотание, 30-40% животных погибают, или подвергаются вынужденному убою.

Возбудитель инфекции - вирус болезни Ибараки - относится к роду Orbivirus семейства Reoviridae и по большинству морфологических и структурных характеристик сходен с другими представителями указанного семейства такими как: вирус эпизоотической геморрагической болезни оленей (ВЭГБО), вирус блютанга (ВБ), вирус африканской чумы лошадей (ВАЧЛ). Геном ВБИ состоит из 10 сегментов двухцепочечной РНК. В результате изучения нуклеотидного состава сегментов генома, а также проведенных серологических исследований был сделан вывод о принадлежности ВБИ к серогруппе ЭГБО и наибольшей его генетической близости со штаммами ВЭГБО, относящимися ко 2 серотипу.

Основными территориями распространения ВБИ являются Япония, Корея, Тайвань. В ходе мониторинговых исследований антитела к ВБИ были обнаружены в крови КРС в Австралии и Индонезии.

ЭГБО является арбовирусной инфекцией и, следовательно, передача вируса между чувствительными животными происходит через укусы насекомых - мокрецов рода Culicoides. Это определяет сезонный характер эпизоотий, регистрируемых, как правило, в конце лета - осенью.

В настоящее время для диагностики ВБИ используют такие методы как: 1) выделение вируса на чувствительной лабораторной модели - культура клеток (первичные культуры клеток почки теленка, овцы, хомячка; перевиваемые клеточные культуры ВНК-21, HmLu-1, L-клетки), куриные эмбрионы, лабораторные животные (мыши); 2) серологические методы исследования (PH, непрямой МФА, различные варианты ИФА); 3) методы молекулярной биологии (различные варианты ПЦР, рестрикционный анализ).

В связи с необходимостью создания быстрых и точных методов диагностики ВБИ был разработан ряд ПЦР, позволяющих выявлять геном указанного вируса. Так, при проведении мониторинговых исследований по выявлению генома ВБИ в пробах мокрецов, собранных на территории Кореи в 2006-2008 гг., использовали стандартную ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) (чувствительность 4,0 lg ТЦД_50/см ³) и гнездовой вариант ПЦР (чувствительность 2,0 lg ТЦД_50/см ³). Праймеры, применявшиеся в стандартной ОТ-ПЦР, были рассчитаны Y. Uchinuno с сотр. и фланкировали участок 3 сегмента генома ВБИ, кодирующего структурный протеин VP3. Положительный результат был зарегистрирован в 20 пробах из 348 (5,75%), которые представляли собой суспензию, приготовленную из пула мокрецов (30-40 особей) на фосфатно-солевом буфере.

Для идентификации возбудителя эпизоотии болезни КРС, зарегистрированной в 1997 г., использовали стандартную ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрицированных фрагментов. Необходимость проведения рестрикционного анализа возникла в связи синтезом специфичного продукта не только в пробах, содержащих РНК ВБИ, но и в образцах ВЭГБО австралийского происхождения (CRISO 439, CRISO 157, CRISO 753, CRISO 775, DPP 59), хотя в пробах североамериканских штаммов ВЭГБО ампликонов соответствующего размера не обнаруживали.

В последние годы для идентификации геномов вирусов стала широко применяться ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Данный метод исключает стадию постановки электрофореза для учета результатов реакции и, как следствие, сокращается время проведения исследования. Кроме того, ПЦР-РВ позволяет осуществлять не только качественный, но и количественный анализ содержания НК в вируссодержащих образцах.

Поэтому целью данного изобретения является разработка способа выявления геномной РНК ВБИ с помощью ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. В основе предложенного варианта ПЦР лежит специфичное связывание сконструированных пары праймеров и зонда с участком 10 сегмента генома ВБИ, кодирующим неструктурные белки NS3 и NS3a.

Поставленная цель достигается способом для обнаружения РНК ВБИ в образцах крови, пробах органов от инфицированных животных и вируссодержащем материале, полученном при выделении вируса в различных чувствительных системах (культуры клеток (КК), куриные эмбрионы (КЭ), мыши). При этом вначале проводят выделение НК из исследуемого материала, затем - синтез комплементарной ДНК (кДНК) на матрице выделенной вирусной РНК, а далее - амплификацию специфичного фрагмента генома ВБИ.

Для выделения НК из исследуемого материала используют метод нуклеосорбции, заключающийся в разрушении клеточных и вирусных мембран и последующем связывании НК с поверхностью сорбента.

Реакцию обратной транскрипции осуществляют в 2 этапа: 1) денатурация цепей РНК (10 мин при 88°С); 2) синтез кДНК на матрице РНК ВБИ (30 мин при 42°С). Для синтеза специфичной кДНК используют пару праймеров IbarF и IbarR.

Полученная кДНК необходима в качестве матрицы при проведении предложенного варианта ПЦР-РВ. Для обеспечения амплификации специфичного фрагмента генома ВБИ к ПЦР-смеси помимо матрицы добавляют олигонуклеотидные праймеры (IbarF и IbarR), фланкирующие данный участок, и флуоресцентный зонд IbarZ.

Нуклеотидный состав указанных праймеров и зонда приведен ниже:

IbarF 5′-GATCAAACCATTTTGCGCTT-3′

IbarR 5′-CTCATCCTCACCGCCTCATTG-3′

IbarZ 5′-[НЕХ] TCTTGTATGGTCAATCCGCTGGCT [ВН2]-3′.

ПЦР-РВ проводят при следующем температурном режиме: 1) 5 мин предварительной денатурации кДНК при 94°С; 2) 5 циклов реакции (денатурация при 94°С - 15 сек, отжиг праймеров при 62°С - 15 сек, элонгация при 72°С - 15 сек); 3) 35 циклов реакции с детекцией на стадии отжига праймеров (денатурация при 94°С - 15 сек, отжиг праймеров при 62°С - 15 сек, элонгация при 72°С - 20 сек). Учет результатов реакции проводят, анализируя кривые накопления флуоресцентного сигнала для каждой пробы с помощью программного обеспечения прибора.

Техническим результатом изобретения является повышение степени специфичности и чувствительности, а также сокращение времени проведения диагностической работы по обнаружению вируса в исследуемых пробах.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных видоспецифичных олигонуклеотидов (IbarF, IbarR, IbarZ) проводят ПЦР-РВ, позволяющую выявить фрагмент генома ВБИ. При наличии в исследуемых образцах РНК вируса болезни Ибараки в ходе ПЦР-РВ синтезируется фрагмент ДНК размером 159 п.н.

Существенным отличием данных праймеров и зонда является то, что они:

1) комплементарны умеренно консервативной области гена, кодирующего неструктурные белки NS3 и NS3a ВБИ, и не комплементарны каким-либо участкам геномов других вирусов;

2) присутствие флуоресцентного зонда увеличивает специфичность реакции и позволяет проводить предварительную идентификацию РНК искомого вируса уже в процессе реакции.

Изобретение иллюстрируется несколькими примерами.

Пример 1. Расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зонда.

С помощью программы «BioEdit 7.0» выравнены доступные в базе данных GenBank нуклеотидные последовательности 10 сегмента генома вируса болезни Ибараки (код доступа GI 118918006) и вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, штамм Alberta (код доступа GI 260590287), являющихся близкородственными вирусами, относящимися ко 2 серогруппе ВЭГБО. В результате анализа указанных последовательностей внутри данного сегмента генома вируса болезни Ибараки выбран участок между 485 и 643 нуклеотидами, отличающийся уникальным нуклеотидным составом. С помощью программы «Oligo 6.0» рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих указанный участок генома в нуклеотидных позициях 485-504 (IbarF) и 623-643 (IbarR). Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентномеченый зонд IbarZ, комплементарный участку, находящемуся внутри нуклеотидной последовательности амплифицируемого фрагмента (нуклеотидные позиции: 573-596).

Основная характеристика рассчитанных олигонуклеотидов представлена в таблице 1.

Пример 2. Экстракция РНК вируса болезни Ибараки из проб крови, органов и вируссодержащего материала, полученного при выделении данного вируса в различных чувствительных системах (КК, КЭ, мыши).

В необходимое количество пробирок объемом 1,5 миллилитра (мл) на N-ное число образцов (включая отрицательный контроль выделения - ОКВ) вносят по 500 микролитров (мкл) лизирующего раствора №1, содержащего гуанидин тиоцианат. Затем в них добавляют по 100 мкл исследуемого материала (кровь, суспензия вируса, 10%-ная суспензия органов), тщательно перемешивают содержимое пробирок и инкубируют при 56°С в течение 5 мин. Далее проводят центрифугирование проб в течение 15 сек при 12000 об/мин для осаждения капель со стенок пробирок, и добавляют к образцам 30-35 мкл предварительно ресуспендированного сорбента «силика». Пробы инкубируют в течение 7-10 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая через каждые 2-3 мин. После этого сорбент осаждают центрифугированием при 10000-12000 об/мин в течение 15 сек и удаляют надосадочную жидкость. К осадку добавляют 300 мкл отмывочного раствора №2, ресуспендируют сорбент и центрифугируют пробы в течение 15 сек при 10000-12000 об/мин с последующим удалением надосадка. Затем сорбент ресуспендируют в 300 мкл отмывочного раствора №3, проводят центрифугирование пробирок с целью осаждения сорбента и удаляют надосадочную жидкость. Осадок сорбента подсушивают при 56°С в течение 4-5 мин, после чего добавляют в пробирки по 50 мкл буфера для элюции (деионизированная вода), перемешивают и инкубируют при 56°С в течение 7-10 мин. После центрифугирования в течение 30 сек при 13400 об/мин пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции.

Пример 3. Синтез кДНК вируса болезни Ибараки на матрице выделенной РНК.

Для получения кДНК отбирают и маркируют необходимое количество пробирок объемом 0,6 мл, соответствующее числу исследуемых образцов (N), включая отрицательный контроль обратной транскрипции (ОКТ) и отрицательный контроль выделения. В каждую пробирку вносят по 7 мкл предварительно перемешанного и осажденного на вортексе буфера для ОТ №1, содержащего по 1 мкл 10 пМ праймеров (IbarF и IbarR) и 5 мкл деионизированной воды. На поверхность реакционной смеси наслаивают по капле (30-40 мкл) минерального масла. При необходимости сбрасывают капли масла со стенок пробирок кратковременным (3-5 сек) центрифугированием. В пробирки под масло вносят по 9 мкл РНК-пробы. Пробирки помещают в термоциклер и продолжают предварительно активизированную программу №1 (денатурация РНК): 1) 88°С - пауза; 2) 88°С - 10 мин, 1 цикл. По окончании программы №1 пробирки переносят в охлажденный до температуры минус 70°С хладагент.

За 5 мин до окончания денатурации РНК в отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь для ОТ на необходимое количество образцов, состоящую из 9,3 мкл буфера для ОТ №2 (4 мкл буфера для обратной транскрипции, 0,3 мкл 25 мМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, 5 мкл деионизированной воды) и 0,2 мкл MMLV-ревертазы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и вносят по 9,5 мкл в пробирки, находящиеся в хладагенте. Пробы помещают в термоциклер и продолжают предварительно активизированную программу №2 (обратная транскрипция): 42°С - пауза; 2) 42°С - 30 мин, 1 цикл. После инкубации реакционную смесь, содержащуюся в пробирках, используют при постановке ПЦР-РВ как препарат кДНК.

Пример 4. Амплификация специфичного участка кДНК ВБИ в процессе ПЦР-РВ.

Для проведения ПЦР-РВ в отдельной пробирке готовят реакционную смесь на необходимое количество образцов (N), в число которых входит отрицательный контроль выделения (ОКВ), отрицательный контроль обратной транскрипции (ОКТ), отрицательный контроль ПЦР (ОК) и положительный контроль ПЦР (ПК). Объем смеси для одной пробы составляет 16 мкл, содержащих: 5 мкл буфера для Taq-полимеразы 5-кратной концентрации, 0,5 мкл 25 мМ MgCl₂, 8 мкл воды (составляют буфер №1), 0,2 мкл 25 мМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, по 10 пМ каждого праймера, 3 пМ флуоресцентного зонда (составляют буфер №2) и 0,2 мкл Taq-полимеразы (20 ед/мкл). Приготовленную смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 16 мкл в предварительно промаркированные пробирки вместимостью 0,2 мл. Затем в каждую пробирку на поверхность смеси наслаивают по 1 капле (15 мкл) предварительно расплавленного воска, служащего барьером между компонентами смеси и матрицей, что предотвращает неспецифичный отжиг праймеров при комнатной температуре до начала ПЦР-РВ.

В подготовленные для ПЦР пробирки со смесью вносят по 9 мкл синтезированной кДНК.

Пробирки помещают в амплификатор «Rotor-Gene 6000» (Corbett Research, Австралия) с программой протекания реакции, приведенной в табл.2.

Флуоресценцию измеряют при 62°С на канале Yellow.

Пример 5. Учет и интерпретация результатов амплификации.

В основе учета результатов реакции лежит анализ кривых накопления флуоресцентного сигнала для каждой пробы с помощью программного обеспечения «Rotor-Gene 6000», версия программного обеспечения 1.8.17.5.

Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (threshold line), что соответствует наличию/отсутствию значения порогового цикла «C_t» в соответствующей графе таблицы результатов.

Результат считается достоверным только в случае прохождения положительного контроля амплификации (ПК) и отсутствия пересечения пороговой линии кривыми флуоресценции для отрицательного контроля амплификации (ОК) и отрицательного контроля выделения РНК (ОКВ).

Образец считают положительным на наличие РНК вируса болезни Ибараки, если значение C_t на канале Yellow составляет менее 33.

Образец считают отрицательным, если по каналу Yellow значение C_t для него отсутствует.

Результаты не подлежат учету, если:

- отсутствует положительный сигнал в пробе с положительным контролем ПЦР. Это может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.

- значение C_t по каналу Yellow превышает 33. В данном случае требуется повторить ПЦР и считать образец положительным в случае повторения результата.

- появляется любое значение C_t в таблице результатов для отрицательного контроля выделения и для отрицательного контроля ПЦР на канале Yellow. Это свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. Поэтому результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Пример 6. Определение чувствительности и специфичности ПЦР-РВ на основе синтетических олигонуклеотидных праймеров и зонда, комплементарных участку 10 сегмента генома ВБИ.

Специфичность метода определили, используя пробы, содержащие РНК вируса болезни Ибараки, близкородственных Орбивирусов (вирус блютанга и вирус эпизоотической геморрагической болезни оленей), а также интактные образцы.

Результаты оценки специфичности ПЦР-РВ с праймерами, комплементарными гену, кодирующему белки NS3/3a вируса болезни Ибараки, представлены в таблице 3.

Таким образом, положительный результат зарегистрировали только в пробах, содержащих РНК ВБИ, что является подтверждением специфичности разработанного метода.

Чувствительность метода определили, используя панель 10-кратных разведений культурального материала, содержащего штамм Susaki ВБИ с титром инфекционной активности 6,5 lg ТЦД₅₀/см³. В результате РНК вируса болезни Ибараки обнаружили в разведении 1:100000, что соответствует 1,5 lg ТЦД₅₀/см³ (таблица 4).

Так как численным выражением концентрации вируса могут являться не только единицы инфекционной дозы, но и количество копий гена-мишени, то для определения чувствительности предложенного метода также использовали количественную ПЦР-РВ на матрице последовательных десятикратных разведений сконструированной рекомбинантной плазмиды.

В результате проведенной ПЦР-РВ установили, что предельным разведением, позволяющим обнаруживать рекомбинантный вектор, являлось 10-ое разведение материала с содержанием плазмиды 4,7214 молекулы/мкл (или 4721,4 молекулы/мл). Учитывая, что в реакцию брали 5 мкл плазмиды, с помощью предложенного метода можно выявлять 24 копии ДНК на реакцию. Это соответствует 24×10³ копиям ДНК в 1 мл.

Источники информации

1. Вирусные болезни животных / Сюрин, В.Н., Самуйленко, А.Я., Соловьев, Б.В., Фомина, Н.В. - М.: ВНИТИБП, 1998. - С.41-43.

2. Получение моноклональных антител и их использование для выявления антител, специфичных к вирусу болезни Ибараки / Новикова, М.Б., Малоголовкин, С.А., Черных, А.А., Вишняков, И.Ф. // Институт эксперим. клин. вет. мед. Информ. бюл. - Харьков, 1995. - С.56.

3. An outbreak of Ibaraki disease in Kagoshima Prefecture in 1997 and properties of the virus isolated from bovine aborted and stillborn fetuses / Watanabe, Y., Makiuchi, H., Imafuji, Т., Yamasaki, K., Onitsuka, Т., Ohashi, S. // J. of the Japan Vet. Med. Ass. - 2000. - vol.53, №5. - P.302-306.

4. An outbreak of Ibaraki disease in Korea / Bak, U.B., Cheong, C.K., Choi, H.I., Lee, C.W., Oh, H.S., Rhee, Y.O., Cho, M.R., Lim, Y.I. // Korean J. Vet. Res. - 1983. - vol.23, №1. - P.81-89.

5. A survey of antibodies to arthropod-borne viruses in Indonezian cattie / Muira, Y., Inaba, Y., Tsuda, Т., Tokuhisa, S., Sato, K., Akashi, H., Matsumoto, M. // J. Vet. Med. Sci. - 1982. - vol.44. - P.857-863.

6. Australian-Indonesian collaboration in veterinary arbovirology a rewiew / Daniels, P.W., Sendow, I., Soleha, E., Sukarsih, N.T. Hunt, Bahri, S. // Vet. Microbiol. - 1995. - vol.46, №1-3. - P.151-174.

7. Differences in Ibaraki virus RNA segment 3 sequences from three epidemics / Uchinuno, Y., Ito, Т., Goto, Y., Miura, Y., Ishibashi, K., Itou, Т., Sakai, T. //J. Vet. Med. Sci. - 2003. - vol.65. - P.1257-1263.

8. Doyle, K.A. An overview and perspective on orbivirus disease prevalence and occurrence of vector in Australia and Oceania / Doyle, K.A. // Blue-tongue, African horse sickness and related orbiviruses / Walton, T.L., Osburn, B.I. - CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla, 1992. - P.44-57.

9. Etiological and epidemiological studies on Ibaraki disease in Taiwan / Liao, Y., Lu, Y., Huang, S., Lee, S. // J. of the Chinese of Vet. Sci. - 1996. - vol.22, №1-3. - P.183-191.

10. Ibaraki virus, an agent of epizootic disease of cattle resembling bluetongue. I. Epidemiologic, clinical and pathologic observations and experimental transmission to calves / Omori, Т., Inaba, Y., Morimoto, Т., Tanaka, Y., Ishitani, R., Kurogi, H., Munakata, K., Matsuda, K., Matumoto M. // Japan J. Microbiol. - 1969. - vol.13. - P.139-157.

11. Identification and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of a variant of the Ibaraki virus from naturally infected cattle and aborted fetuses in Japan / Ohashi, S., Yoshida, K., Watanabe, Y., Tsuda, T. // J. Clin. Microbiol. - 1999. - vol.37, №12. - P.3800-3803.

12. Isolation and identification of Ibaraki virus in the 1991 epidemics of acute febrile disease of cattle in Korea / Park, B.K., Chang, C.H., Chung, C.W., Rhee, J.C., Son, D.S., Lee, K.W. // RDA. J. Agri. Sci. - 1994. - vol.36, №1. - P.558-561.

13. Kitano, Y. Ibaraki disease in cattle / Kitano, Y. // Infectious Disease of livestock / Coetzer, J.A.W., Tustin, R.C. - Oxford: Oxford University Press, 2004. - P.1221-1226.

14. Lu, Y. Aetiological and epidemiological studies on Ibaraki disease in Taiwan / Lu, Y., Li, Y., Liou, P. // Proceedings of the First Southeast Asia and Pacific Regional Bluetongue Symposium. - Cnina, 1996. - P.91.

15. Monitoring of five bovine arboviral diseases transmitted by arthropod vectors in Korea / Shin, Y.-K., Oem, J.-K., Yoon, S., Hyun, B.-H., Cho, I.-S., Yoon, S.-S., Song, J.-Y. // J. of Bacteriology and Virology. - 2009. - vol.39, №4. - P.353-362.

16. Suzuki, Y. Double-stranded RNA of Ibaraki virus / Suzuki, Y., Nakagawa, S., Saito, Y. // Virology. - 1977. - vol.76. - P.670-674.

17. Occurrences of Ibaraki disease in two successive years: possibly caused by virus overwintering / Uchinuno, Y., Ishibashi, K., Yokoyama, A., Ka-wanabe, M., Takagi, E. // J. of the Japan Vet. Med. Ass. - 2000. - vol.53, №6. - P.372-376.

18. RNA and protein of Ibaraki virus / Suzuki, Y., Nakagawa, S., Saito, Y., Namiki, M. // Kitasato Arch. Exp. Med. - 1978. - vol.51. - P.61-71.