Результат интеллектуальной деятельности: РЕКОМБИНАЦИОННАЯ КАССЕТА, СОДЕРЖАЩАЯ ГЕНЫ EP153R И EP402R ШТАММА Ф-32 ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ DswCongo/FranceLectinCD2 ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и генной инженерии, в частности к штаммам вируса африканской чумы свиней (АЧС), и может быть использовано в научно-исследовательских институтах для изучения роли белков вируса АЧС (C-type lectin-like protein и CD2v) в репродукции вируса в культурах клеток, в восприимчивых животных, а также их функций в модуляции иммунного ответа.

На сегодняшний день в России создалась напряженная обстановка по африканской чуме среди свиней. На территорию нашей страны АЧС была занесена в ноябре 2007 г., заболевание диагностировали у кабанов в Шатойском районе Республики Чечня. В последующие годы (2007-2014 гг.) вспышки болезни регистрировали еще в 35 субъектах России.

Африканская чума свиней - особо опасная болезнь свиней вирусной этиологии, характеризующаяся лихорадкой, геморрагическим диатезом, воспалительными и некродистрофическими изменениями паренхиматозных органов. АЧС относится к группе трансграничных инфекций животных, декларируемых ФАО как болезни, которые оказывают существенное влияние на экономику, торговлю и продовольственную безопасность значительного количества стран, могут легко распространиться из одной страны в другую и достигать эпидемических масштабов. К африканской чуме свиней восприимчивы домашние и дикие свиньи, независимо от возраста. Вирус АЧС также инфицирует отдельных представителей клещей рода Ornithodoros.

В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV), вирус АЧС является уникальным представителем семейства Asfarviridae, рода Asfivirus. Геном вируса представлен линейной двухцепочечной молекулой ДНК, размером от 170 до 190 тыс. п.о.

Несмотря на многолетние исследования, до сих пор не разработаны эффективные средства специфической профилактики АЧС. Неоднократные попытки создания «классических» инактивированных и живых аттенуированных вакцин, ДНК-вакцин и вакцин на основе рекомбинантных антигенов не увенчались успехом.

В странах Африканского, Американского и Европейского континентов выделено более 400 штаммов и изолятов вируса АЧС. Данные исследований различных штаммов демонстрируют, что вирус АЧС обладает выраженным плюралитетом по патогенности, иммуногенности, антигенности, способности вызывать гемадсорбцию [3]. По результатам Bastos et all., 2003 получены данные о существовании 22 генотипов вируса АЧС, на основе филогенетического анализа участка гена р72 [5]. Все отмеченные генотипы вируса циркулируют на территории африканского континента и могут быть субтипированы на группы и субтипы с использованием анализа нуклеотидных последовательностей вариабельных областей генома [4]. Генотипирование вируса АЧС позволило проследить географическое распространение и молекулярную эволюцию возбудителя, однако абсолютно не коррелировало с данными о протективных свойствах различных изолятов.

Предположения о существовании нескольких иммунологических типов вируса АЧС появились в 30-х годах прошлого столетия и получили экспериментальное подтверждение на рубеже 50-60 годов. De Tray D. обнаружил антигенные различия африканских изолятов Хинде, Уганда, Тенгани в реакции задержки гемадсорбции [3]. Используя эту реакцию и иммунологическую пробу на животных, Malmquist W. доказал существование антигенной множественности изолятов, выделенных в Африке [6]. Им установлено семь иммунологических и серологических типов с референс-штаммами: Л-57, Л-60, Хинде-2, Родезия, Дакар, 2743, Мозамбик. Однако представители даже одного иммунологического типа сильно отличались между собой по фенотипическим и биологическим свойствам, что позволило предположить участие регуляторных и репродуктивных систем вируса в данном феномене.

Согласно разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии классификации, в основу которой положены результаты РЗГАд типоспецифическими сыворотками и иммунобиологической пробы на свиньях, имеющиеся в коллекции института изоляты вируса АЧС разделены на 8 серогрупп [1]. Наиболее изученными являются штаммы вируса, отнесенные к I-IV серогруппам. Референс-штаммом I-ой серогруппы определен штамм «Лиссабон 57», II-ой - «Конго 49», III-ей - «Мозамбик 78», IV-ой «Франция 32». Генетические маркеры, определяющие принадлежность к определенной серогруппе, не были выявлены.

Филогенетический анализ более 70 штаммов вируса АЧС, проведенный в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, показал корреляцию между генетическими кластерами на основе нуклеотидных последовательностей генов EP153R и EP402R и серогруппами. Полученный рекомбинантный вирус АЧС позволит определить роль С-type lectin-like protein и CD2v в модуляции механизмов иммунного ответа.

Современные исследования по изучению роли отдельных генов вируса АЧС в основном направлены на создание рекомбинантных (химерных) вирусов с измененными или удаленными генами с дальнейшим изучением фенотипических свойств данных вирусов на культурах клеток и восприимчивых животных.

Среди штаммов вируса АЧС различают вирулентные штаммы, выделенные от инфицированных животных, или авирулентные штаммы, полученные путем аттенуации вируса в культурах клеток гомологичного или гетерологичного происхождения [2]. Однако данные штаммы не могут быть использованы для изучения роли отдельных генетических элементов формировании фенотипа вируса.

Целью данного изобретения является получение нового рекомбинантного авирулентного штамма вируса африканской чумы свиней DswCongo/FranceLectinCD2, обладающего стабильными иммуногенными, гемадсорбирующими и патогенными свойствами для изучения роли белков вируса АЧС (C-type lectin-like protein и CD2v) в репродукции вируса в культурах клеток, в восприимчивых животных, а также их функций в модуляции иммунного ответа.

Поставленная цель достигается путем создания рекомбинантного штамма вируса АЧС с измененными генами EP153R и EP402R, содержащего репортерный ген EGFP. Штамм DswCongo/FranceLectinCD2 получен из аттенуированного штамма KK-262 вируса африканской чумы свиней путем гомологичной рекомбинации. Рекомбинационная кассета представляет собой рекомбинантную плазмиду на основе вектора pUC19, содержащая фрагменты генов EP152R и EP364R (плечи рекомбинации), штамма KK-262 вируса АЧС, полноразмерные гены EP153R и EP402R штамма Ф-32, а также репортерный ген EGFP (Рис. 1). Рекомбинантный штамм вируса содержит в своем составе гены EP153R и EP402R из штамма ФК-32 вируса АЧС, кодирующие белки C-type lectin-like protein и CD2v соответственно. Рекомбинантные клоны вируса были получены при одновременной трансфекции культуры клеток COS-1 рекомбинационной кассетой и инфицировании ее вирусом АЧС штамм KK-262 (Рис. 2). Для дальнейшего скриннинга клонов использовали метод предельных разведений (12 последовательных пассажей на перевиваемой культуре клеток COS-1) и селекции мутантных вариантов вируса по репортерной флюоресценции гена EGFP. Чистота клональной популяции рекомбинантного вируса была подтверждена в ГПДР со специфическими праймерами, фланкирующими фрагмент гена EP402R штамма KK-262 вируса АЧС. Отсутствие нуклеотидных замен в сайте рекомбинации определяли нуклеотидным секвенированием фрагментов генома вируса.

Полученный рекомбинантный авирулентный штамм обозначен как штамм «DswCongo/FranceLectinCD2» и депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под №3076.

Молекулярно-генетические свойства.

Проводили генетическую идентификацию полученного рекомбинантного штамма DswCongo/FranceLectinCD2 вируса африканской чумы свиней и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности фрагмента генома. Использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с последующим секвенированием продуктов амплификации. ДНК выделяли из 0,2 мл культуры клеток макрофагов свиней, инфицированной рекомбинантным вирусом с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Германия), согласно инструкции изготовителя. ПНР проводили с праймерами, комплементарными фрагментам генов EP152R, EP153R, EP402R, EP364R и представленными в таблице 1.

Типовая принадлежность.

Определение серотипа проводили в реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд) с использованием полученных ранее в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии референс-сывороток. По результатам РЗГАд рекомбинантный штамм DswCongo/FranceLectinCD2 вируса АЧС отнесен к IV серогруппе. Тогда как штамм КК-262 вируса АЧС, из которого был получен рекомбинантный вирус, по результатам РЗГАд относится к II серогруппе.

Культуральные свойства.

Рекомбинантный штамм DswCongo/FranceLectinCD2 вируса АЧС размножается в первичных культурах клеток костного мозга свиней (KMC) и макрофагов свиней, а также в перевиваемой культуре клеток COS-1. Репродукция вируса в культуре клеток костного мозга сопровождается адсорбцией эритроцитов свиней на мембране инфицированных клеток (феномен гемадсорбции) и их последующим лизисом. В культуре клеток макрофагов свиней также отмечается округление клеток и отслоение от субстрата на 2 день после заражения. Инфицированные клетки формируют кластеры, которые разрушаются по мере репродукции вируса на 3-4 день после заражения. Репродукция вируса в культуре клеток COS-1 не сопровождается выраженным ЦПД. Накопление вируса, как в первичных, так и перевиваемой культуре клеток составляет 6,0-7,0 lg ГАЕ 50/см³.

Патогенные свойства.

Штамм DswCongo/FranceLectinCD2 вируса АЧС не является патогенным для свиней при внутримышечном заражении в дозе 2*10⁶ ГАЕ 50/см³. У инфицированных животных отмечено кратковременное повышение температуры до 40,5-41,0°С на 3-5 день после инфицирования. Вирусная ДНК в пробах крови на 3, 5, 7, 13 и 21 день после заражения методом ПЦР в режиме реального времени не обнаруживается. Клинических признаков болезни не отмечено.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами.

Рекомбинантный штамм DswCongo/FranceLectinCD2 не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами.

Условия хранения.

Рекомбинантный штамм DswCongo/FranceLectinCD2 хранят при минус 40°С в виде лиофилизированной культуры клеток COS-1, инфицированной рекомбинантным штаммом вируса АЧС. Периодичность освежения штамма один раз в 10 лет.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Создание рекомбинационной кассеты.

Для получения рекомбинантного штамма

DswCongo/FranceLectinCD2 вируса АЧС была сконструирована рекомбинационная кассета, представляющая собой рекомбинантную плазмиду на основе вектора pUC19, содержащая фрагменты генов EP152R и EP364R штамма KK-262 вируса АЧС, полноразмерные гены EP153R и EP402R штамма Ф-32, а также репортерный ген EGFP, кодирующий зеленый флюоресцентный белок, под контролем промотера р72 вируса АЧС. Фрагменты генов EP152R и EP364R штамма KK-262 являлись плечами рекомбинации. Клонирование всех фрагментов в бактериальный вектор проводили последовательно с использованием фермента Т4 ДНК-лигазы (NEB, США).

Пример 2.

Рекомбинантный штамм DswCongo/FranceLeetinCD2 получен из аттенуированного штамма KK-262 вируса африканской чумы свиней путем гомологичной рекомбинации. Рекомбинантные клоны вируса были получены при одновременной трансфекции культуры клеток COS-1 рекомбинационной кассетой и инфицировании ее штаммом KK-262 вируса АЧС. В результате гомологичной рекомбинации по плечам рекомбинации (фрагментам генов EP152R и EP364R) полученный рекомбинантный вирус содержал гены EP153R и EP402R гетерологичного штамма Ф-32, а также репортерный ген EGFP. Для дальнейшего скриннинга клонов использовали метод предельных разведений (12 последовательных пассажей на перевиваемой культуре клеток COS-1) и селекции мутантных вариантов вируса по репортерной флюоресценции за счет введенного в состав вируса гена EGFP. Чистота клональной популяции рекомбинантного вируса была подтверждена в ГШР со специфическими праймерами, фланкирующими фрагмент гена EP402R штамма KK-262 вируса АЧС. Отсутствие нуклеотидных изменений в сайте рекомбинации определяли путем нуклеотидного секвенирования.

Пример 3.

Определение типовой принадлежности рекомбинантного штамма DswCongo/FranceLectinCD2.

Типовая принадлежность рекомбинантного штамма DswCongo/FranceLectinCD2 определена в РЗГАд в культуре клеток макрофагов со специфическими референс-сыворотками II и IV серогрупп по разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии методике. Установлено, что специфическая референс-сыворотка IV серогруппы вызывает задержку гемадсорбции штамма DswCongo/FranceLectinCD2. На основании этих исследований рекомбинантный штамм вируса АЧС DswCongo/FranceLectinCD2 отнесен к IV серогруппе.

Краткое описание чертежей:

Рис. 1. Рекомбинационная кассета, используемая для получения рекомбинантного штамма DswCongo/FranceLectinCD2v вируса АЧС. pUC19 содержит фрагменты генов EP152R и EP364R (плечи рекомбинации), штамма KK-262 вируса АЧС, полноразмерные гены EP153R и EP402R штамма Ф-32, а также репортерный ген EGFP под контролем р72 промотора.

Рис. 2. Схема получения рекомбинантного вируса DswCongo/FranceLectinCD2. Рекомбинантные клоны вируса были получены при одновременной трансфекции культуры клеток COS-1 рекомбинационной кассетой и инфицировании ее вирусом АЧС штамм KK-262.

Используемые источники

1. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней. И.Ф. Вишняков, Н.И. Митин, Ю.И. Петров // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: Материалы научно-практической конференции ВНИИВВиМ. - Покров. - 1995. С. 141-143.

2. Черятников Л.Л. Получение аттенуированных вариантов из различных изолятов вируса АЧС и их сравнительная оценка. / Л.Л. Черятников, Ю.И. Петров, Н.И. Митин // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии 1992. - 4.1. - С. 56.

3. D.Е. De Tray, African swine fever / De Tray D.E., // Adv. Vet. Sci. Comp. Med. - 1963. - №19. P. 299-333.

4. Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR) genes / Gallardo C., Mwaengo D.M., Macharia J.M., Arias M., Taracha E.A., Soler A. // Virus Genes. - 2009. - №38. - P. 85-95.

5. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterization / Bastos ADS, Penrith ML, Cruciere C, Edrich JL, Hutchings G, Roger F, Couacy-Hymann E, Thomson GR // Arch. Virol. - 2003. - №148. P. 693-706.

6. W. Malmquist, D. Hay, Haemadsorption and cytopathic effect produced by African swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures / Malmquist W., Hay D. // J. Vet. Res. - 1960. - №21. P. 104-108.