Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ У ДЕТЕЙ, ПОТРЕБЛЯЮЩИХ ВОДУ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ МАРГАНЦА

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам лабораторной диагностики формирования патологического дисбаланса обмена нейромедиаторов у детей, приводящего к формированию заболеваний нервной системы, например, таких как неврозоподобный синдром, задержка речевого и нервно-психического развития, обусловленных реализацией специфического действия марганца на детей, потребляющих воду с повышенным его содержанием.

Марганец входит в список основных показателей качества воды по требованиям санитарных норм РФ, ВОЗ, США, ЕС; включен в приоритетный список загрязняющих веществ воды водных объектов (Решение Европарламента и Совета EC №2455/2001/EC). Марганец стабильно присутствует в подземных водах и в воде открытых водоемов в виде взвешенных и коллоидных частиц. Основными источниками поступления марганца в воду открытых водоемов являются сбросы предприятий черной и цветной металлургии, машиностроения и металлообработки, вклад которых в валовый внутренний продукт ВВП России составляет порядка 20-30%. В составе сбросов сточных вод данный металл поступает в воду открытых водоемов, а затем - в результате нарушений условий водоподготовки и транспортировки - в питьевую воду. Значительное количество марганца поступает в воду поверхностных и подземных водных источников естественным путем, в результате выщелачивания железомарганцевых руд и других минералов почвогрунтов, разложения водных животных и растительных организмов. По своему воздействию на организм марганец при поступлении с питьевой водой относится к умеренно опасным веществам (3 класс опасности). Он характеризуется, наряду с общерезорбтивным действием, развитием специфического эффекта повреждающего действия со стороны центральной нервной системы (ЦНС).

Из уровня техники выявлены следующие группы технических решений, являющиеся аналогами к предлагаемому изобретению:

- способы диагностики заболеваний нервной системы;

- способы диагностики заболеваний нервной системы от воздействия токсикантов;

- способы диагностики различных заболеваний (исключая нервные заболевания) от воздействия тяжелых металлов и, в частности, марганца.

Известен способ ранней диагностики дисфункции и типа дисфункции вегетативной нервной системы у детей и подростков (Патент РФ №2338459), согласно которому в первой половине дня натощак последовательно проводят вегетативные пробы - пробу с контролируемой частотой дыхания (ПКЧД) и пробу с физической нагрузкой (ПФН) с периодом отдыха между ними в течение 5-10 мин. Фиксируют I период времени, соответствующий 3-минутному интервалу в конце 30-минутного периода спокойного бодрствования, II период, соответствующий 3-минутному интервалу времени от начала проведения ПКЧД, III период, соответствующий 3-минутному интервалу времени от начала проведения ПФН. Рассчитывают для каждого периода SDNN, дельта X, Mo, LF, HF, отношение LF/HF и по наличию выраженных изменений временных показателей, а именно более 3% при проведении ПКЧД и 5% при ПФН по сравнению с их уровнем в покое, выраженных изменений спектральных показателей более 10% при ПКЧД и более 15% при ПФН диагностируют наличие синдрома вегетативной дисфункции. При значениях низкочастотного показателя LF более 1400 мс², высокочастотного HF менее 900 мс², отношении LF/HF больше или равно 2,5 при проведении ПФН диагностируют синдром вегетативной дисфункции по симпатикотоническому типу, при значениях низкочастотного показателя LF более 1200 мс², высокочастотного HF более 1050 мс², отношении LF/HF меньше или равном 1,2 по данным ПКЧД-синдром вегетативной дисфункции по ваготоническому типу. Указанный способ расширяет арсенал средств для диагностики дисфункции и типа дисфункции вегетативной нервной системы у детей и подростков.

Также известен способ диагностики синдромов детского церебрального паралича ДЦП (Патент РФ №2226983), согласно которому проводят определение концентрации микроэлементов в биологическом материале, при этом в качестве исследуемого материала используют взвесь эритроцитов, в которых определяют одновременно содержание фосфора, меди, лития и кадмия и при наличии нормальных показателей концентраций меди и снижении концентраций фосфора, кадмия и лития относительно нормы диагностируют гипертензионный синдром, а при увеличении концентраций кадмия, фосфора, лития и меди диагностируют судорожный синдром. Данный способ позволяет установить степень тяжести заболевания для прогнозирования дальнейшего течения.

Однако, этот способ не является способом ранней диагностики заболевания нервной системы, а только диагностикой синдромов детского церебрального паралича. А кроме того, ДЦП является заболеванием, в этиологии которого лежит органическое поражение центральной нервной системы, поэтому экологический компонент здесь минимален.

Вместе с этим, оба вышеуказанных известных способа не позволяют устанавливать токсическое действие тяжелых металлов на нервную систему.

Из уровня техники известен ряд патентов на способы оценки воздействия химических техногенных факторов на нервную систему населения:

- «Способ диагностики нейроинтоксикации высшими алифатическими аминами жирного ряда» (Патент РФ №1781607). Сущность: производят смешивание суспензии лейкоцитов пациента с равными объемами 0,5% взвеси глютаризированных эритроцитов барана, нагруженных дофамином. Смесь инкубируют в течение 10-15 мин при 37,0-37,5°C, центрифугируют, делают мазок, фиксируют его, высушивают, окрашивают по Романовскому-Гимза. Просматривают под микроскопом 100 лимфоцитов, отмечая среди них клетки, фиксировавшие на себе три и более эритроцитов барана (РОК). При увеличении количества РОК, специфичных дофамину по сравнению с нормой (7,8±0,8%), диагностируют нейроинтоксикацию высшими алифатическими аминами жирного ряда.

- «Способ диагностики интоксикации организма серосодержащими веществами» (Патент РФ №1291124), в нем клинически выявляют астеновегетативные синдромы путем проведения рефлексограммы ахиллесова рефлекса, регистрируемой до и после контакта с серосодержащими веществами. Исследуют время рефлекторной реакции по интервалу SM, простирающемуся от момента нанесения раздражения до середины фазы мышечной реакции. Исследования проводят раздельно с правого и левого ахиллесова сухожилия по пять перкуссий с каждой стороны. На основании полученных кривых определяют среднеарифметический параметр для каждого рефлекса, определяя таким образом интервал SM. Критерий нейроинтоксикации - увеличение интервала SM на 50 мс и более от исходного значения.

- «Способ диагностики токсической энцефалопатии от воздействия комплекса токсических веществ» (Патент РФ №2279091). Сущность способа: пациенту проводят либо электроэнцефалографию и биохимическое исследование крови, при которых определяют β2-индекс по ээг, уровень каталазы, уровень гидроперекиси липидов, уровень β-липопротеидов, либо стандартизированное многофакторное исследование личности (СМИЛ) и тест Спилбергера - Ханина на реактивную тревожность, при которых определяют показатели шкалы 1 (Hs), K, 3 по СМИЛ и уровень реактивной тревожности по тесту Спилбергера - Ханина, на основании полученных данных рассчитывают диагностический коэффициент, который сравнивают с константой. При значении коэффициента больше константы диагностируют токсическую энцефалопатию. Пациентами с токсической энцефалопатией являлись пожарные, подвергшиеся воздействию комплекса токсических веществ: винилхлорида, двуокиси серы, фтористого водорода, диоксинов, фуранов, окиси углерода и других токсичных газов.

Однако все указанные три известных способа не позволяют диагностировать заболевания нервной системы от воздействия марганца, поступающего с питьевой водой, т.к., во-первых, не предусматривают измерение концентрации токсиканта в биосредах пациента, а во-вторых, используют показатели, которые характеризуют развитие нейротоксических изменений на стадии формирования органического нарушения, а не на донозологической стадии.

Из уровня техники также известны способы, обеспечивающие выявление токсического действия тяжелых металлов, в том числе и марганца, на здоровье человека:

- «Способ прогнозирования патологии почек у детей, проживающих в регионе с высокой антропогенной нагрузкой тяжелыми металлами» (Патент РФ №2234251). Согласно этому способу у детей определяют комплекс анамнестических и клинико-лабораторных показателей: наличие профессиональной вредности у родителей на производстве, наследственную отягощенность по патологии органов мочевой системы, развитие функциональных нарушений почек, наличие сочетанной пищеварительной, сердечно-сосудистой, нервной, эндокринной патологии, гипотонии, микрогематурии, снижение антикристаллобразующей способности мочи, гипероксалурии, гипераминоацидурии, этаноламинурии, бетта-2-микроглобулинурии, повышения циркулирующих иммунных комплексов в крови, степень сенсибилизации к тяжелым металлам, понижение уровня кортизола в крови, содержание хрома, марганца, свинца, кадмия и кобальта в волосах и моче, рассчитывают сумму диагностических коэффициентов. При повышении цитотоксического индекса к тяжелым металлам свыше 0,15 и снижении уровня кортизола в сыворотке крови более чем в 2 раза в сочетании с накоплением нефротоксических тяжелых металлов в биосредах и суммой диагностических коэффициентов, равной +70 и более, определяют риск формирования нефропатий. Способ позволяет своевременно выявить детей с высоким риском развития почечной патологии и провести превентивные мероприятия.

- «Способ определения токсичности действия тяжелых металлов на организм (Патент РФ №2138816), согласно которому определяют содержание тяжелых металлов в сыворотке крови и дополнительно лабораторный показатель - активность каталазы в эритроцитах, и при ее снижении (при норме 72,5-106,1 с-1/г гемоглобина) в сочетании с повышенным уровнем тяжелых металлов по сравнению с нормой действие последних определяют как токсическое. Данный способ верифицирован только с характером течения гастроэнтерологической патологии, что делает его малоинформативным для выявления других донозологических форм нарушений здоровья детей, в частности, касающихся ЦНС.

- «Способ определения токсичности действия марганца на организм детей, проживающих в условиях техногенной нагрузки среды обитания (Патент РФ №2437095), согласно которому при одновременном установлении достоверных зависимостей: повышенный уровень марганца в крови - пониженный уровень антиоксидантной активности и/или повышенный уровень малонового диальдегида в плазме крови, действие марганца определяют как токсичное. Однако указанный известный способ недостаточно информативен, т.к. отражает только работу антиоксидантной системы организма и неприменим для диагностики заболеваний нервной системы, т.к. используемые лабораторные показатели не могут быть достоверными маркерами развития донозологической стадии заболеваний нервной системы.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы диагностики у детей заболеваний нервной системы, ассоциированных с внешнесредовым воздействием марганца, поступающего в организм с питьевой водой, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении точности ранней диагностики, еще на донозологической стадии, у детей заболеваний нервной системы, ассоциированных с воздействием марганца, поступающего с питьевой водой, за счет расширения информационных связей между содержанием марганца в биологической среде (крови) и предлагаемыми лабораторными показателями, отражающими соотношение нейромедиаторов, регулирующих процессы возбуждения и торможения в центральной нервной системе.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом ранней диагностики заболеваний нервной системы у детей, потребляющих воду с повышенным содержанием марганца, согласно которому устанавливают дозы марганца, поступающего в организм ребенка с питьевой водой, в пробе крови ребенка определяют содержания марганца и лабораторные показатели: уровень гамма-аминомасляной кислоты и содержание глутамата в сыворотке крови, далее проводят корреляционный анализ зависимости «доза марганца из питьевой воды - содержание марганца в крови», дополнительного проводят корреляционный анализ между самими указанными лабораторными показателями и уровнем марганца в крови, и при одновременном установлении достоверных зависимостей: повышенный уровень марганца в крови - пониженный уровень гамма-аминомасляной кислоты и/или повышенный уровень глутамата в сыворотке крови, диагностируют донозологическую стадию, предшествующую развитию заболеваний нервной системы у детей, потребляющих воду с повышенным содержанием марганца.

Новый способ позволяет установить зависимость влияния дозы марганца, поступающего с питьевой водой, на формирование дисбаланса нейромедиаторов, что позволяет использовать его для формирования доказательной базы негативных эффектов, вызванных воздействием марганца на здоровье детского населения.

Поставленный технический результат достигается за счет следующего.

Следует пояснить, что воздействие марганца на функциональное состояние ЦНС реализуется счет того, что этот металл при поступлении в организм легко проникает через гематоэнцефалический барьер, кумулирует в митохондриях и лизосомах. Угнетая активность митохондриальных ферментов, данный металл вызывает нарушения в митохондриальной дыхательной цепи переноса электронов. В результате интенсивного образования активных форм кислорода происходит необратимая модификация нуклеиновых кислот и белков, нарушение целостности мембран нейронов, высвобождение эксайтотоксических медиаторов (одним из которых является глутамат).

В нервных клетках декарбоксилирование глутамата (отщепление α-карбоксильной группы) приводит к образованию гамма-аминомасляной кислоты (далее - γ-АМК), которая служит основным тормозным медиатором высших отделов мозга. В результате избыточного поступления марганца в организм первично повреждаются астроциты (клетки нейроглии), развивается глиальная дисфункция, следствием чего является поражение нейронов и нарушение процесса декарбоксилирования глутамата, что способствует эксайтотоксическому эффекту. Именно астроциты контролируют концентрацию марганца в мозге. Поврежденные астроциты могут утрачивать способность захватывать и обезвреживать избыточные количества возбуждающей аминокислоты - глутамата. В наибольшей степени страдают проекционные γ-АМК-ергические нейроны. В результате повышается уровень глутамата в крови, а уровень γ-АМК снижается, что является одним из основных функциональных предпосылок для развития донозологической стадии заболеваний нервной системы.

Благодаря тому, что в предлагаемом способе в качестве лабораторных характеристик (показателей) учитывают активность γ-АМК и глутамата, это позволяет оценить активность процессов торможения и возбуждения в ЦНС, что дает комплексную оценку формирующегося функционального нарушения.

Использование корреляционного анализа обеспечивает дополнительную информационную связь лабораторных показателей с содержанием марганца в крови, уровень которого достоверно коррелирует с повышенным содержанием марганца в воде, и одновременно информационная связь между самими указанными лабораторными показателями, что делает способ более точным и достоверным.

Использование в качестве показателей активность γ-АМК и глутамата, являющимися специфическими маркерами негативного воздействия повышенного уровня в крови марганца на функциональную активность ЦНС, позволяет повысить информативность способа для формирования доказательной базы негативных эффектов, вызванных воздействием металлов на здоровье детского населения.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет на ранней стадии, еще до проявления клинических признаков, прогнозировать вероятность развития неврозоподобного синдрома и задержку речевого и нервно-психического развития, обусловленных формированием дисбаланса нейромедиаторов.

Все это повысит эффективность планирования санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, в частности марганца, обуславливающих экологически обусловленную патологию у детей в виде заболеваний нервной системы.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом, реализуя его на конкретном примере:

- выбирают экологически неблагополучную территорию с содержанием марганца в питьевой воде, стабильно превышающим уровень предельно-допустимой концентрации (ПДК) (ПДК равен 0,1 мг/дм³). В качестве такой территории был выбран поселок Юго-Камский, характеризующийся превышением гигиенических нормативов качества питьевой воды по содержанию марганца в среднем до 2,3-3,3 ПДК;

- отбирают случайным образом группу детей (группа наблюдения), проживающих на этой территории. Было отобрано 147 детей из организованного коллектива. В обследовании принимали участие дети, прошедшие утренний фильтр, следовательно, без клинических проявлений заболеваний.

- у указанной группы детей проводят отбор венозной цельной крови в две пробирки. Одну пробирку используют для определения содержания марганца в цельной крови. Вторую пробирку - для получения сыворотки крови.

- в цельной крови из первой пробирки определяют уровень содержания марганца методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на масс-спектрометре Agilent 7500 сх (США) с октопольной реакционной/столкновительной ячейкой, в качестве газа-реактанта использовали гелий Не.

- в сыворотке крови, полученной из второй пробирки, определяют лабораторные показатели: уровень гамма-аминомасляной кислоты и содержание глутамата;

- для проведения сравнительного анализа, в качестве группы сравнения было обследовано 100 детей из района с относительно благоприятной санитарно-гигиенической ситуацией в отношении питьевой воды;

- далее выполняют процедуру оценки риска в соответствии с Руководством по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ 2.1.10.1920-04, определяют среднюю суточную дозу марганца поступающего с питьевой водой,

- проводят математическое моделирование, отражающее зависимость увеличения концентрации марганца в крови детей от увеличения среднесуточной дозы данного вещества при экспозиции из питьевой воды. В качестве параметров моделей используют рассчитанные дозы исследуемых компонентов в питьевой воде и уровни содержания марганца в крови детей. Оценка адекватности моделей выполнена по критерию Фишера с 95% уровнем достоверности и коэффициенту детерминации.

- далее проводят расчет вероятности изменения исследуемых показателей, включая линейный корреляционный анализ (зависимости показателей детей из группы наблюдения: повышенный по сравнению с референтным уровень марганца в крови более 0,011 мг/дм³ - пониженный уровень активности γ-АМК в сыворотке крови; повышенный по сравнению с референтным уровень марганца в крови более 0,011 мг/дм³ - повышенный уровень глутамата в сыворотке крови; пониженный уровень активности γ-АМК - повышенный уровень глутамата в сыворотке крови).

Проверка статистических гипотез относительно полученных корреляционных зависимостей проводится с использованием критерия Стьюдента. Различия считают статистически значимыми при вероятности (достоверности) p<0,05.

Анализ определяемых концентраций марганца в крови при обследовании 147 детей в группе наблюдения позволил установить статистически достоверное повышенное содержание марганца относительно референтного уровня и показателя в группе сравнения в среднем до 1,3 раза (максимальное превышение - до 4,4 раза) (p=0,01). При этом в группе наблюдения установлено до 54% проб крови с повышенным содержанием марганца относительно референтного уровня и показателя в группе сравнения (средняя концентрация превысила референтный уровень в 2,1 раза, p≤0,001) у 74% обследованных. Различия с группой сравнения были достоверны (p=0,003). В группе сравнения средняя концентрация марганца в крови не превышала референтного уровня, который равен 0,011±0,002 мг/дм³.

В результате лабораторного обследования детей из группы наблюдения установлено, что частота регистрации проб с повышенным содержанием возбуждающей аминокислоты - глутамата - в сыворотке крови детей составила 56,3%, что в 4,2 раза выше относительно рассматриваемого физиологического уровня и показателя у детей группы сравнения (p=0,001). При этом среднее значение данного показателя у детей группы наблюдения составило 148,87±16,77 мкмоль/дм³, что в 1,5 раза превысило аналогичный показатель у детей группы сравнения.

Достоверно установлена причинно-следственная связь между повышенным содержанием марганца в крови и вероятностью повышения уровня глутамата в сыворотке крови (отношение шансов OR=3,4; доверительный интервал DI=2,2-4,4; p=0,002; коэффициент детерминации R²=0,64; критерий Фишера F=145,06; p=0,000). Частота встречаемости пониженного уровня тормозного нейромедиатора γ-АМК в сыворотке крови детей группы наблюдения составило 89,5%, что в 4,8 раза превысило аналогичный показатель у детей группы сравнения и физиологического уровня (p=0,000). При этом среднее значение данного показателя составило 0,05±0,01 мкмоль/дм³, что практически в 2 раза ниже относительно аналогичного показателя в группе сравнения (p=0,000). Установлена достоверная зависимость вероятности понижения уровня γ-АМК в сыворотке крови от повышенного уровня марганца в крови (OR=4,5; DI=3,7-5,8; p=0,000; R²=0,80, F=287,55, p=0,000).

В группе сравнения зафиксировано, что средние значения данных показателей составили для глутамата - 107,60±13,81 мкмоль/дм³ и γ-АМК - 0,09±0,01 мкмоль/дм³, что находилось в пределах физиологических уровней.

- затем сопоставляют уровень марганца в цельной крови с уровнем γ-АМК в сыворотке крови и уровнем глутамата в сыворотке крови. При значении уровня γ-АМК ниже нормы (референтный уровень равен 0,077 мкмоль/дм³) в сочетании с повышением уровнем содержания глутамата (референтный уровень равен 83,24 мкмоль/дм³) в сыворотке крови на фоне повышенного уровня марганца в цельной крови, при установлении достоверных зависимостей: повышенный уровень марганца в крови - пониженный уровень γ-АМК и/или повышенный уровень глутамата в сыворотке крови, действие марганца определяют как способствующее возникновению заболеваний нервной системы у детей, связанное с потреблением питьевой воды с повышенным содержанием марганца.

Оценка результатов математического моделирования причинно-следственных связей позволила установить зависимость снижения активности γ-АМК сыворотки крови и повышения уровня глутамата сыворотки крови от повышения концентрации в крови марганца, также была установлена зависимость снижения уровня активности γ-АМК сыворотки крови и повышения уровня глутамата сыворотки крови. Данные приведены в таблицах 1 и 2.

У детей группы сравнения корреляционная зависимость между снижением уровня γ-АМК сыворотки крови и повышением глутамата сыворотки крови от повышения концентрации в крови марганца была не достоверна (p>0,05).

Дальнейшими углубленными исследованиями установлено, что длительное потребление питьевой воды с содержанием марганца на уровне до 3,3 ПДК приводит к увеличению относительно показателей в контроле на 9-13% уровня заболеваний нервной системы, включающих неврозоподобный синдром; задержку речевого и нервно-психического развития. Вероятность возникновения дополнительных случаев заболеваний среди обследованных 147 детей по классу болезней нервной системы может составить 22 случая в год.

Также в ходе лабораторных испытаний было установлено, что предлагаемым способом нельзя диагностировать у детей заболевания нервной системы, ассоциированных с поступлением марганца в организм ребенка другим путем, например, через воздух.