Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К БАКТЕРИАЛЬНЫМ АНТИГЕНАМ

Изобретение относится к ветеринарной медицине и может быть использовано для определения наличия в сыворотке или плазме крови животных, человека и птицы антител к бактериальным антигенам.

Известен способ определения антител к Mycobacterium leprae в реакции латекс-агглютинации (патент RU 2501022 C2, оп. 10.12.2013). В способе используют тест-антиген в концентрации 28 мкг/мл для сенсибилизации 1,4% суспензии полистироловых латексных частиц с аминогруппами 2 мг-экв/мл, диаметром 0,62 мкм в течение 8 часов при комнатной температуре и 18 часов при температуре 8°C, полученный ультразвуковой дезинтеграцией при 18 кГц в течение 30 минут из культивируемых в условиях термостата на среде Левенштейна-Иенсена в течение 7 суток при температуре 37°C Mycobaterium lufii. Способ позволяет сократить время и проводить исследования в полевых условиях.

Недостатками известного способа являются ограниченные функциональные возможности последнего, поскольку он предназначен только для диагностики лепры, а также не предусмотрено определение титра антител.

Известен способ диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных, включающий определение наличия антител к антигенам семи серогрупп L. hebdomadis, L. pomona, L. tarassovi, L. grippotyphosa, L. canicola, L. sejroe и L. icterohaemorrhagiae в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, при этом в качестве антигена применяют смешанные в равных количествах антигенные белки из лептоспир трех серогрупп - L. tarassovi, L. grippotyphosa и L. hebdomadis (патент RU 2493569 C1, опубл. 20.09.2013).

Недостатками известного способа являются ограниченные функциональные возможности последнего, поскольку он предназначен только для диагностики лептоспироза с. -х. животных, а также длительность и невозможность проведения исследования в полевых условиях.

Известен способ получения бруцеллезного L-антигена для диагностики бруцеллеза, заключающийся в следующем (патент RU 2486916 С2, опубл. 10.07.2013). Культивируют штамм Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясопептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) с добавлением 10-15%) нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток. Затем полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5%) фенолизированным физиологическим раствором, инактивируют взвесь при температуре 85-90°C в течение 60 минут, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд м.к., а полученный антиген титруют, стандартизируют по специфичности и активности.

Однако известный способ предназначен только для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных с персистенцией измененных L-форм возбудителя.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ определения антител к бактериальным антигенам, включающий подготовку антигена, смешивание последнего с сывороткой тестируемой крови в одном разведении и проведение реакции агглютинации в лунках микропланшета с U-образным дном с последующим учетом реакции фотометрически (ЕР 0433629 A1, оп. 26.06.1991).

Недостатками известного способа являются большой расход антигена, невозможность визуального учета реакции, а также недостаточная точность учета результатов реакции агглютинации (РА).

Техническим результатом заявленного способа является повышение точности определения антител к бактериальным антигенам, а также снижение расхода антигена.

Технический результат достигается предлагаемым способом, заключающемся в использовании нативной суспензии инактивированных бактериальных клеток, меченных флюоресцентным красителем, при этом бактериальные клетки вносят в лунки микропланшета с V-образным дном, куда предварительно добавляют разведенную исследуемую сыворотку крови.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Антиген готовят из культуры микроорганизмов следующим образом

Делают смыв суточной культуры бактерий, выращенных на твердой питательной среде, по стандартной методике (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.О. Биргер, В.В. Аврех, В.В. Влодавец с соавт., 1973 год, с. 137-139).

Культуру бактерий инактивируют любым неразрушающим бактериальные клетки способом, например нагреванием с учетом видовой термостабильности. Суспензию инактивированных бактерий (антиген) метят путем добавления флюоресцентной метки, представляющей собой 1,0% водный раствор интеркалирующего ДНК флюоресцентного красителя, выбранного из группы: бромистый этидий, пропидия иодид, акридиновый оранжевый. Несвязавшийся с антигеном флюоресцентный краситель отмывают путем центрифугирования суспензии антигена.

Антиген разводят фосфатно-солевым буфером до минимальной концентрации, обеспечивающей образование феномена агглютината «пуговка», светящегося в ультрафиолетовых лучах.

Реакцию агглютинации проводят следующим образом.

Сыворотку крови разводят в лунках микропланшета с V-образным дном в фосфатно-солевом буфере с шагом 1:2, затем проводят реакцию агглютинации с суспензией флюоресцентно-меченого антигена в течение 4-16 часов (добавив его ко всем разведениям сыворотки крови в равном объеме).

Детекцию реакции агглютинации осуществляют с помощью источника ультрафиолетового излучения, преимущественно с помощью трансиллюминатора. При наличии положительной реакции на дне лунки образуется феномен агглютината в виде «зонтика», а в случае отрицательной реакции бактериальные клетки скапливаются на дне лунок в виде «пуговки», которая выглядит более ярко светящейся точкой на общем фоне. Далее определяют титр тестируемой сыворотки, на котором сохранилась агглютинация, т.е. предельную степень разбавления сыворотки крови, при котором не наблюдается образование «пуговки», либо устанавливают сам факт отсутствия реакции агглютинации разных разведений тестируемых сывороток крови с соответствующим бактериальным антигеном (в этом случае наблюдается наличие «пуговок» на дне лунок планшета).

Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа является:

- в качестве антигена используют флюоресцентно-меченую суспензию инактивированных бактериальных клеток, что позволяет повысить точность определения антител к бактериальным антигенам, а также снизить расход антигена, так как суспензию бактерий перед проведением реакции предварительно разводят до минимальной концентрации, обеспечивающей флюоресценцию в лунке, т.е. используют в 10-100 раз меньшую концентрацию антигена, чем при учете реакции в видимом свете;

- антиген смешивают с тестируемой сывороткой крови в различных разведениях, что позволяет точно определить титр тестируемых сывороток за счет того, что несколько повторов реакции агглютинации разных разведений одной и той же пробы сыворотки позволяет снизить вероятность ошибки учета реакции агглютинации;

- реакцию агглютинации проводят в лунках микропланшета с V-образным дном, что позволяет повысить точность учета результатов реакции агглютинации за счет того, что в отличие от лунок с U-образным дном бактериальные клетки быстрее смещаются на дно лунки по стенкам и формируют более компактное скопление, что повышает интенсивность флюоресценции и упрощает дифференциацию «пуговки» от «зонтика»;

- учет результатов реакции агглютинации осуществляют с помощью источника ультрафиолетового излучения, преимущественно трансиллюминатора, что позволяет повысить точность определения антител и обеспечить возможность как визуального, так и приборного учета результатов реакции агглютинации, а также снизить расход антигена.

Изобретение иллюстрируется конкретными примерами выполнения способа.

Пример 1.

Антиген готовили из культуры Salmonella enterica серотипа enteritidis следующим образом. Делали смыв суточной культуры сальмонелл на агаре Хоттингера, суспензию ресуспендировали в небольшом объеме физиологического раствора (2-3 бактериальных петли культуры на 0,2 мл жидкости). Культуру сальмонелл инактивировали нагреванием при 65°C в течение 2-х часов. К суспензии инактивированных бактерий добавляли 10 мкл 1,0% водного раствора бромистого этидия (из расчета на 1 мл суспензии) и инкубировали 30 минут. Суспензию разводили до объема 15 мл фосфатно-солевым буфером (0,01 М, pH 7,2-7,0) и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку добавляли еще 15 мл фосфатно-солевого буфера. Повторяли этап отмывки еще два раза. К осадку добавляли 1 мл фосфатно-солевого буфера. Подбирали степень разбавления бактериального антигена путем оценки его светимости в ультрафиолетовых лучах. Для этого в лунки микропланшета вносили по 100 мкл фосфатно-солевого буфера (0,01 М, pH 7,2-7,0), в первую лунку вносили 100 мкл концентрированного антигена и делали серийные разведения с шагом 1:2.

Реакцию агглютинации ставили следующим образом.

Во все лунки микропланшетов вносили по 75 мкл фосфатно-солевого буфера. В первый горизонтальный ряд, отдельными наконечниками вносили по 25 мкл сыворотки и перемешивали, получая разведение 1:4. В качестве заведомо положительных образцов использовали сыворотки крови от кур, привитых против сальмонеллеза инактивированной вакциной (10 проб). В качестве заведомо отрицательных проб использовали сыворотки крови цыплят-бройлеров, не контактировавших с сальмонеллами (10 проб).

Многоканальной пипеткой из первого ряда лунок отбирали 100 мкл сыворотки и переносили во второй ряд лунок. Таким образом, меняя носики, титровали сыворотку с шагом 1:2. В лунки вносили по 100 мкл флюоресцентно-меченого антигена и инкубировали 4 часа. Микропланшет фотографировали в ультрафиолетовых лучах с использованием трансиллюминатора.

При наличии положительной реакции образовывался «зонтик», в случае отрицательной реакции, бактериальные клетки скапливались на дне лунок в виде «пуговки», которая выглядела более ярко светящейся точкой на общем фоне.

Далее определяли титр тестируемой сыворотки, на котором сохранилась агглютинация. За положительную реакцию принимали сыворотку с титром антител к антигену более чем 1:4.

Результаты эксперимента отражены в таблице 1, из которой видно, что заявляемый способ позволяет повысить точность визуализации результатов РА, а именно однозначно и надежно выявить наличие антител к антигену S. enterica серотипа enteritidis.

Пример 2.

Для оценки специфичности определения антител к сальмонеллам разных серотипов (инфантис и энтеритидис) исследовали сыворотку крови от цыплят бройлеров птицефабрики, неблагополучной по сальмонеллезу, вызванному S. infantis. Реакцию агглютинации ставили аналогично примеру 1, за исключением того, что в лунки с тестируемой разведенной сывороткой крови вносили по 100 мкл флюоресцентно-меченого антигена и смесь инкубировали 16 часов.

Результаты исследования представлены в таблице 2, где РА - реакция агглютинации. Как следует из таблицы 2, у цыплят бройлеров, зараженных сальмонеллой серотипа инфантис, встречаются антитела к антигенам S. infantis, но не встречаются антитела к антигенам сальмонелл серотипа энтеритидис (в диагностически значимых титрах выше 1:4).

Пример 3.

Провели оценку чувствительности реакции при использовании различных флюоресцентных красителей для мечения антигена.

Антиген готовили из культуры Salmonella enterica серотипа enteritidis следующим образом. Делали смыв суточной культуры сальмонелл на агаре Хоттингера, суспензию ресуспендировали в небольшом объеме физиологического раствора (2-3 бактериальных петли культуры на 0,2 мл жидкости). Культуру сальмонелл инактивировали нагреванием при 65°C в течение 2-х часов.

Суспензию инактивированных бактерий разделили на три части

К образцу №1 суспензии инактивированных бактерий (антиген) добавляли 10 мкл 1,0% водного раствора бромистого этидия (на 1 мл суспензии) и инкубировали 30 минут.

К образцу №2 суспензии инактивированных бактерий добавляли 10 мкл 1,0% водного раствора пропидия иодида (на 1 мл суспензии) и инкубировали 30 минут.

К образцу №3 суспензии инактивированных бактерий добавляли 10 мкл 1,0% водного раствора акридинового оранжевого (на 1 мл суспензии) и инкубировали 30 минут.

Все образцы суспензии разводили до объема 15 мл фосфатно-солевым буфером (0,01М, pH 7,2-7,0) и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку добавляли еще 15 мл фосфатно-солевого буфера. Повторяли этап отмывки еще два раза. К осадку добавляли 1 мл фосфатно-солевого буфера. Подбирали степень разбавления бактериального антигена путем оценки его светимости в ультрафиолетовых лучах. Для этого в лунки микропланшета вносили по 100 мкл фосфатно-солевого буфера (0,01М, pH 7,2-7,0), в первую лунку вносили 100 мкл концентрированного антигена и делали серийные разведения с шагом 1:2.

Реакцию агглютинации проводили аналогично примеру 1.

В качестве заведомо положительных образцов использовали сыворотки крови от кур, привитых против сальмонеллеза инактивированной вакциной (10 проб). В качестве заведомо отрицательных проб использовали сыворотки крови цыплят-бройлеров, не контактировавших с сальмонеллами (10 проб).

Микропланшет фотографировали в ультрафиолетовых лучах с использованием трансиллюминатора.

Далее определяли титр тестируемой сыворотки, на котором сохранилась агглютинация. За положительную реакцию принимали сыворотку с титром антител к антигену более чем 1:4

Результаты эксперимента при использовании различных флюоресцентных красителей для мечения антигена были идентичны - все пробы сыворотки крови от кур, привитых против сальмонеллеза инактивированной вакциной (10 проб) характеризовались положительной реакцией агглютинации вне зависимости от используемого красителя и все пробы сыворотки крови цыплят-бройлеров, не контактировавших с сальмонеллами, были отрицательным при использовании разных образцов антигена.

Пример 4.

Для оценки возможности проведения дифференциальной диагностики бактериальных инфекций исследовали предложенным способом наличие антител в сыворотке крови к четырем бактериальным антигенам, полученным из культур Staphylococcus albus, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumonia. Все культуры были выделены у павших от бактериального сепсиса свиней из внутренних органов. Сыворотка крови была получена от животных того же стада. Приготовление бактериальных антигенов и проведение реакции агглютинации проводили аналогично примеру 1.

Результаты исследования представлены в таблице 3. Из таблицы 3 следует, что среди поголовья свиней не происходило контакта с иммунной системой таких бактерий, как Staphylococcus albus, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumonia, что свидетельствует о недостаточном патогенном потенциале этих бактерий для проникновения через слизистые барьеры и развития инфекционного процесса. Наличие антител к кишечной палочке (E. coli) позволяют говорить о патогенной роли этого микроорганизма.

Таким образом, использование предлагаемого способа определения антител к бактериальным антигенам позволяет быстро готовить новые антигены из культур микроорганизмов различных видов (для изготовления теста на основе иммуноферментного анализа потребуются существенно большие затраты времени и более жесткие требования по очистке антигена), что обеспечивает значительную универсальность метода, облегчает возможность интеграции результатов микробиологических исследований с серологическими, а использование флюоресцентно-меченого антигена позволяет упростить и автоматизировать проведение и учет реакции.