Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОРОТКИХ РНК ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ

Изобретение относится к области молекулярной биологии и диагностической медицины и может быть использовано для выделения коротких рибонуклеиновых кислот (РНК) из биологических жидкостей.

Термин «короткие рибонуклеиновые кислоты (короткие РНК)» по данному описанию в контексте настоящего изобретения означает фрагменты РНК с длиной до 50 нуклеотидов, представленные такими известными молекулами РНК, как микроРНК (miRNA), малые интерферирующие РНК (siRNA) и piwi-взаимодействующие РНК (piRNA), а также, потенциально, фрагменты расщепления более длинных молекул РНК, такие как матричные РНК (mRNA), рибосомальные РНК (rRNA), транспортные РНК (tRNA), ядерные и ядрышковые РНК (snRNA и snoRNA), длинные некодирующие РНК (lncRNA) и др.

Наибольший интерес из коротких РНК для диагностической медицины представляют циркулирующие в крови и находящиеся в других биологических жидкостях микроРНК, которым посвящено огромное количество исследований (1). МикроРНК представляют собой короткие (18-24 нуклеотида), не кодирующие белок, молекулы РНК, регулирующие экспрессию множества генов на посттранскрипционном уровне. МикроРНК участвуют практически во всех базовых процессах от момента возникновения организма: эмбриональном развитии, пролиферации, дифференцировке, старении, иммунном и стрессорном ответах, геномном импринтинге, в ключевых процессах метаболизма. Исследования последних лет показали, что микроРНК сами могут выступать в роли онкогенов и супрессоров опухолевого роста, при развитии самых разнообразных опухолей.

Основным препятствием в выделении высококачественных препаратов коротких РНК из биологических жидкостей является высокое содержание в них биополимеров ненуклеотидной природы (белки, липопротеины, липиды и их комплексы), в том числе входящих в комплексы с микроРНК, присутствие в них ингибиторов ферментов, используемых в последующем анализе (например, ПЦР), а также высокое содержание ферментов, расщепляющих нуклеиновые кислоты.

Таким образом, получение высокоочищенных препаратов недеградированных коротких РНК, пригодных для последующего анализа (ОТ-ПЦР, микрочиповый анализ, полногеномное секвенирование), является актуальной проблемой в молекулярной биологии.

В настоящее время для получения коротких РНК из биологических жидкостей традиционно используются способы, основанные на фенольной экстракции. Эти способы отличаются трудоемкостью, многостадийностью, сложностью в постановке и использованием токсичных химических реагентов (фенол).

Известен, например, способ выделения коротких РНК, включающий смешивание образца, растворенного в 4М растворе гуанидин изотиоцианата с водонасыщенным фенолом в кислой среде, с последующим разделением фаз при помощи добавления хлороформа (2). При центрифугировании такой смеси суммарная РНК остается в верхней водной фазе, белки образуют интерфазу, а ДНК переходит в органическую фазу. Варианты последующей очистки включают переосаждение спиртами или дополнительную очистку РНК, например, на стекловолоконных сорбентах.

Недостатками данного способа являются трудоемкость, использование токсичных химических реагентов, а также получение на выходе препарата суммарной РНК, специально необогащенной по содержанию короткими РНК.

Для обогащения короткими РНК в ряде коммерческих наборов (miRVANA, miRNeasy и др.) используется дополнительная стадия очистки на стекловолоконных сорбентах.

Известен способ выделения коротких РНК из биологических жидкостей, основанный на предварительной очистке препарата от биополимеров ненуклеотидной природы при помощи их осаждения (miRCURY) с последующим выделением рибонуклеиновых кислот из супернатанта на стекловолоконном сорбенте (3).

Всем вышеперечисленным способам присущ общий недостаток, заключающийся в потере части РНК при отделении нецелевых фракций.

Наиболее близким к заявляемому способу прототипом является способ выделения коротких РНК, основанный на известном методе фенольной экстракции (4), заключающийся в следующем. Образец плазмы денатурируют в буфере, содержащем 4М гуанидин изотиоцианат, проводят кислую фенольную экстракцию и разделяют органическую и водную фазы при помощи хлороформа. К верхней водной фазе прибавляют равный объем 96% этилового спирта (этанола) и наносят на колонку со стекловолоконным сорбентом, например производства Биосилика (BioSilica Ltd, Россия). Колонку отмывают от несвязавшихся биополимеров и избытка химических агентов (гуанидин изотиоцианат, хлороформ) согласно рекомендациям производителя и элюируют короткие РНК раствором для элюции, содержащим 10 мМ бикарбонат натрия. В отдельных случаях для дополнительной очистки от присутствия солей в образце проводят переосаждение коротких РНК, например, спиртами.

Недостатками известного способа являются: трудоемкость, возрастающая пропорционально количеству образцов, многостадийность, использование токсичных химических реагентов (фенол) и недостаточный выход целевого продукта. Кроме этого способ невозможно автоматизировать.

Задачей изобретения является получение препарата высокоочищенных недеградированных коротких РНК, пригодных для последующего анализа при помощи высокоточных молекулярно биологических методов, таких как ОТ-ПЦР, микрочиповый анализ и полногеномное секвенирование.

Технический результат: упрощение способа, сокращение его длительности и повышение выхода коротких РНК.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Образец биологической жидкости подвергают двухстадийной денатурации при помощи буферного раствора, содержащего хаотропный агент (гуанидин изтиоцианат), и органических растворителей (спирт, хлороформ). Для первичной денатурации белковых комплексов и инактивации ферментов, расщепляющих РНК, к образцу биологической жидкости добавляют два объема буферного раствора, содержащего 6,0-6,75 М гуанидин изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1,5% 2-меркаптоэтанол, и инкубируют в течение 5 минут. Для полной денатурации белковых комплексов, а также растворения липопротеиновых комплексов и везикулярных структур к полученной смеси добавляют два объема 96% этанола и равный объем хлороформа, перемешивают и отделяют супернатант центрифугированием. Затем супернатант (денатурированный образец биологической жидкости) наносят на стекловолоконный сорбент, например на колонку «Биосилика», (BioSilica Ltd, Россия), при помощи фильтрационной установки либо центрифуги. Колонку дважды отмывают от несвязавшихся биополимеров буферным раствором, содержащим 50% этанол, 25% хлороформ, 1 М гуанидин изотиоцианат, 2,5 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1% 2-меркаптоэтанол. Далее сорбент дважды промывают от избытка химических агентов буферным раствором, содержащим 10 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 0,1 М NaCl, 75% этанол, и элюируют короткие РНК с сорбента буферным раствором, содержащим 1-15 мМ бикарбонат натрия, 5-50 мМ раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1% 2-меркаптоэтанол или 0,5-50 мМ ЭДТА, предварительно нагретым до 85-95°C. В результате получают препарат коротких РНК, имеющих длину от 16 до 50 нуклеотидов.

В качестве биологических жидкостей могут выступать плазма крови, сыворотка крови, моча, молоко, спинномозговая жидкость, альвеолярные смывы и т.д.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются:

1. Образец биологической жидкости подвергают двухстадийной денатурации, при этом на первой стадии к образцу добавляют два объема денатурирующего раствора, содержащего 6,0-6,75 М гуанидин изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1,5% 2-меркаптоэтанол, а на второй стадии к полученной смеси добавляют два объема 96% этанола и равный объем хлороформа, что позволяет повысить выход коротких РНК и сократить длительность способа за счет исключения необходимости проведения фенольной экстракции.

2. Отмывку сорбента от несвязавшихся биополимеров осуществляют дважды буферным раствором, содержащим 50% этанол, 25% хлороформ, 1 М гуанидин изотиоцианат, 2,5 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1% 2-меркаптоэтанол, повторяющим состав денатурирующих растворов, что позволяет дополнительно повысить эффективность выделения коротких РНК.

3. Элюцию коротких РНК с сорбента осуществляют буферным раствором, содержащим 1-15 мМ бикарбонат натрия, 5-50 мМ ЭДТА, 1% 2-меркаптоэтанол или 0,5-50 мМ раствором ЕДТА, предварительно нагретым до 85-95°C, что позволяет повысить выход и сократить время выделения коротких РНК.

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:

- позволяет выделять короткие РНК без использования фенола с большей эффективностью (~110%) и воспроизводимостью (5% против 20% для фенольной экстракции) по сравнению с использованием традиционных методов фенольной экстракции;

- упрощает процедуру выделения коротких РНК, уменьшает количество стадий обработки образца и позволяет сократить время выделения коротких РНК в 2,7 раза (с 49 до 18 минут).

Сопоставительный анализ заявляемого способа по сравнению с прототипом представлен в таблице 1.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного использования метода

Пример 1.

К 100 мкл плазмы здорового донора прибавляют 200 мкл денатурирующего раствора, содержащего 6 М гуанидин изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1,5% 2-меркаптоэтанол, и инкубируют в течение 5 минут. В смесь плазмы и денатурирующего буфера вносят 100 нг ³²Р-меченого синтетического рибоолигонуклеотида длиной 22 нуклеотида. К полученной смеси добавляют 600 мкл 96% этанола и 300 мкл хлороформа, перемешивают, инкубируют 5 мин и центрифугируют при 17000 g в течение 5 минут, при этом допускается образование небольшой опалесценции раствора. Супернатант наносят на колонку со стекловолокнистым сорбентом Биосилика (BioSilica Ltd, Россия). Сорбент промывают дважды 300 мкл буфера, содержащего 50% этанол, 25% хлороформ, 1 М гуанидин изотиоцианат, 2,5 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1% 2-меркаптоэтанол, при центрифугировании при 400 g в течение 1 минуты.

Затем сорбент промывают дважды 300 мкл буфера, содержащего 10 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 0,1 М NaCl, 75% этанол, при 400 g в течение 1 минуты. Короткие РНК элюируют буфером для элюции, содержащим 1 мМ бикарбонат натрия, 5 мМ ЭДТА, 1% 2-меркаптоэтанол, в течение 10 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 400 g одну минуту и затем при 17000 g одну минуту. В результате получают препарат, представляющий смесь коротких РНК с длиной от 16 до 50 нуклеотидов, с выходом 54,9%.

Эффективность выделения целевого продукта определяют по удельной радиоактивности полученного препарата коротких РНК и аликвот из промежуточных стадий на счетчике бета-частиц по Черенкову.

Пример 2.

Короткие РНК выделяют из плазмы крови аналогично примеру 1 за исключением того, что используют денатурирующий буфер, содержащий 6,75 М гуанидин изотиоцианат, далее сорбент отмывают, как в примере 1, а для элюции коротких РНК используют 1 мМ раствор ЭДТА, предварительно нагретый до 95°C. В результате получают препарат, представляющий смесь коротких РНК с длиной от 16 до 50 нуклеотидов, с выходом 56,0%.

Пример 3.

Короткие РНК выделяли из мочи 20 здоровых доноров при помощи способа-прототипа и предлагаемого способа следующим образом: к 400 мкл мочи прибавляли 800 мкл денатурирующего раствора, содержащего 6,5 М гуанидин изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, 15 мМ ЭДТА, pH 6.5, 1,5% 2-меркаптоэтанол, и инкубировали в течение 5 минут. К полученной смеси добавляли 2400 мкл 96% этанола и 1200 мкл хлороформа, перемешивали, инкубировали 1 мин и центрифугировали при 17000 g в течение 5 минут, при этом допускается образование небольшой опалесценции раствора. Супернатант наносили на колонку со стекловолокнистым сорбентом Биосилика (BioSilica Ltd, Россия). Сорбент дважды промывали 300 мкл буфера, содержащего 50% этанол, 25% хлороформ, 1 М гуанидин изотиоцианат, 2,5 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1% 2-меркаптоэтанол, при центрифугировании при 400 g в течение 1 минуты. Затем сорбент дважды промывали 300 мкл буфера, содержащего 10 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 0,1 М NaCl, 75% этанол при 400 g в течение 1 минуты. Короткие РНК элюировали буфером, содержащим 15 мМ бикарбонат натрия, 50 мМ ЭДТА, 1% 2-меркаптоэтанол, в течение 5 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 400 g 1 минуту, а затем при 13000 g 1 минуту.

Короткие РНК, выделенные способом-прототипом и предлагаемым способом, подвергали дополнительной очистке для последующего определения концентрации с помощью количественной ОТ-ПЦР. Для этого к полученным элюатам добавляли 30 мкг гликогена, 1/10 объема 3 М ацетатного буфера (NaOAc), pH 7.4 и равный объем изопропанола, инкубировали 30 минут при -20°C и центрифугировали при 13000 g в течение 15 мин при 4°C. Супернатант удаляли, осадок последовательно промывали 75% и 96% этанолом, центрифугируя при 13000 g 5 минут при 4°C. Осадок сушили на воздухе и растворяли в воде.

Выход коротких РНК определяли по концентрации шести микроРНК: miR-16, miR-21, miR-126, miR-125b, miR-183, miR-19b - при помощи количественной ОТ-ПЦР (5). Результаты выделения коротких РНК из мочи способом-прототипом и предлагаемым способом представлены в таблице 2.

Данный пример иллюстрирует, что препараты коротких РНК, выделенные из мочи с использованием предлагаемого способа, пригодны для исследования при помощи количественных молекулярно-биологических методов, например анализа микроРНК при помощи ОТ-ПЦР.

Пример 4.

Короткие РНК выделяли из плазмы крови 20 здоровых доноров при помощи способа-прототипа и предлагаемого способа. Выделение коротких РНК из плазмы с помощью предлагаемого способа проводили следующим образом: к 100 мкл плазмы прибавляли 200 мкл денатурирующего раствора, содержащего 6М гуанидин изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1,5% 2-меркаптоэтанол, и инкубировали в течение 5 минут. К полученной смеси добавляли 600 мкл этанола и 300 мкл хлороформа, перемешивали, инкубировали 5 мин и центрифугировали при 17000 g в течение 5 минут, при этом допускается образование небольшой опалесценции раствора. Супернатант наносили на колонку Биосилика (BioSilica Ltd, Россия) под вакуумом. Сорбент дважды промывали 300 мкл буфера, содержащего 50% этанол, 25% хлороформ, 1 М гуанидин изотиоцианат, 2,5 мМ Трис-ацетат, pH 6.5,1% 2-меркаптоэтанол, при 400 g в течение 1 минуты. Затем сорбент дважды промывали 300 мкл буфера, содержащего 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0,1 М NaCl, 75% этанол, при 400 g в течение 1 минуты. Короткие РНК элюировали 50 мМ раствором ЭДТА, предварительно нагретым до 85°C, в течение 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 400 g 1 минуту и затем при 17000 g 1 минуту.

Для осаждения коротких РНК к раствору коротких РНК добавляли 30 мкг гликогена, 12 мкл 3 М NaOAc, pH 7.4 и 265 мкл изопропанола, инкубировали 30 минут при -20°C и осаждали короткие РНК центрифугированием при 13000 g в течение 15 мин при 4°C. Супернатант убирали, а осадок последовательно промывали 75% и 96% этанолом, центрифугируя при 7500 g 5 минут при 4°C. Осадок сушили на воздухе и растворяли в воде.

Выход коротких РНК определяли по концентрации шести микроРНК: miR-16, miR-21, miR-126, miR-125b, miR-183, miR-19b - при помощи количественной ОТ-ПЦР. Результаты выделения коротких РНК из плазмы крови способом-прототипом и предлагаемым способом представлены в таблице 3.

Данный пример иллюстрирует, что препараты коротких РНК, полученные из плазмы крови с использованием предлагаемого способа, пригодны для исследования при помощи количественных молекулярно-биологических методов, например анализа микроРНК при помощи ОТ-ПЦР.

Использование предлагаемого способа позволит значительно упростить известные способы выделения коротких РНК, сократить его длительность и повысить выход целевого продукта.

Источники информации

1. de Planell-Saguer М., Rodicio М.С. Analytical aspects of microRNA in diagnostics: A review. // Analytica Chimica Acta. - 2011. - V. 699. - P. 134-52.

2. Peng J., Xia Z., Chen L., Shi M., Pu J., Guo J., Fan Z. Rapid and efficient isolation of high-quality small RNAs from recalcitrant plant species rich in polyphenols and polysaccharides. // PLoS One. - 2014. - V. 9. - P. e95687.

3. Sedlackova Т., Repiska G., Minarik G. Selection of an optimal method for coisolation of circulating DNA and miRNA from the plasma of pregnant women. // Clin. Chem. Lab. Med. - 2014.

4. Chomczynski P., Sacchi N. The single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. // Nature Protocols. - 2006. - V. 1. - P. 581-585.

5. Chen C., Ridzon D.A., Broomer A.J. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. // Nucleic Acids Res. - 2005. - V. 33. - P. e179.