Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ПОВЕРХНОСТЬ ДЕТОНАЦИОННЫХ НАНОАЛМАЗОВ

Изобретение относится к химическим методам иммобилизации галодифа на поверхность детонационных наноалмазов, которые в дальнейшем могут быть использованы для придания пролонгации действия или целенаправленной доставки галодифа.

Важной проблемой фармацевтической отрасли является продление времени действия лекарственных препаратов, так как во многих случаях необходимо длительное поддержание строго определенной концентрации препаратов в биожидкостях и тканях организма. Немаловажной задачей является и поиск идеальных систем доставки лекарственных препаратов, так как заболевания поражают, прежде всего, отдельные органы и ткани. Медикаменты, каким бы способом их ни вводили, распределяются по всему организму более или менее равномерно. А для того чтобы они попали в патологический очаг, необходим носитель, который бы доставил препараты к месту назначения. В качестве носителя чаще всего используют наноалмазы, так как они являются биологически инертными материалами и имеют развитую поверхность.

Для функционализации поверхности детонационных наноалмазов органическими молекулами использует разные способы, например, в патенте (Патент РФ №2473464, МПК С01В 31/06, от 30.11.2010) предложен способ, заключающийся в воздействии гамма-излучения на наноалмазный порошок в инертной атмосфере в присутствии фторсодержащего вещества (политетрафторэтилен), при этом процесс проходит при 300-350°С.

К подобным адсорбционным методам функционализации поверхности наноалмазов можно отнести также способ получения лекарственного контейнера, предложенный в патенте РФ №2406536 (МПК A61K 47/04, от 17.09.2008). Способ заключается в использовании порошка наноалмазов с размером частиц менее 10 нм, который помещают в пресс-форму и формуют при давлении 50-300 МПа. Сформованную заготовку термообрабатывают в среде газообразных углеводородов в течение времени, обеспечивающего получение пористости 40-75 об.%. Получают неорганическую основу, выполненную из биосовместимого углеродного композиционного материала, представляющего собой частицы наноалмаза, связанные

графитоподобным углеродом. Заполняют поры полученной основы лекарственным препаратом пропиткой раствором лекарственного препарата или адсорбцией лекарственного препарата из его раствора.

К недостаткам этого метода следует отнести тот факт, что данный метод позволяет получать только объемные наполненные материалы, что существенно замедляет процессы сорбции и не обеспечивает достаточной прочности связывания молекул лекарственного препарата и поверхности неорганической основы.

Стоит отметить, что в качестве наноносителя для иммобилизации биомолекул можно использовать и другие материалы, например оксид титана (патент РФ №2444571, МПК C12N 15/11, от 28.05.2008). В данном патенте предложено использовать наночастицы диоксида титана, на которые иммобилизованы полиаминовые производные олигонуклеотидов (PA-oligo). Полиамины содержат от 3 до 1000 аминогрупп в молекуле и преимущественно представляют собой полилизин, полиэтиленимин и спермин. Наночастицы диоксида титана могут находиться как в аморфном состоянии, так и в окристаллизованном (анатаз, брукит). Данные нанокомпозиты могут проникать в клетки путем обычного эндоцитоза, без применения электропорации и других методов, нарушающих целостность клеточной мембраны. При этом в способе указано на приготовление нанокомпозитов диоксида титана, на которые иммобилизованы конъюгаты олигонуклеотида с линкером, что позволяет получать конъюгаты олигонуклеотидов с полиаминами с выходом 90-100%.

Вместе с тем, авторы не приводят методов иммобилизации низкомолекулярных лекарственных препаратов на поверхности наночастиц оксида титана. Кроме того, связывание полиаминовых производных олигонуклеотидов реализуется с участием катион-анионных взаимодействий, что затрудняет миграцию олигонуклеотидов в жидкие среды организма.

К химическим методам функционализации поверхности относится также способ образования ковалентной связи между углеродом на поверхности наноматериала и остатком органической молекулы от ароматических солей диазония. Подобный способ функционализации был предложен в патенте РФ №2405655 (МПК B22F 1/0, от 04.08.2008), в котором проводят функционализацию наноразмерных порошков с использованием арилдиазоний тозилатов в водной среде. Недостатком метода является то, что в примерах функционализации нет макромолекул и не показана прививка молекул лекарственных препаратов. Кроме того, содержания активных групп на поверхности наноразмерных порошков явно недостаточно для получения нанокомпозитов с содержанием лекарственного препарата, достаточным для обеспечения фармакологического эффекта.

В работе Р.-Н. Chung и др.[Р.-Н. Chung, Ε. Perevedentseva, J.-S.Tu, С.С. Chang, С.-L. Cheng. Spectroscopic study of bio-functionalized nanodiamonds // Diamond & Related Materials. 2006. - 15. - 622-625] был предложен метод биофункционализации лизоцимом поверхности наноалмазов. Предлагаемый авторами метод заключается в предварительном окислении поверхности наноалмазов в смеси H₂SO₄ и HNO₃ (9:1) в течение 3 суток при перемешивании, температуре 75°С. Далее окисленные алмазы обрабатывали последовательно 0,1 Μ NaOH и 0,1 Μ HCl при температуре 90°С в течение 2 часов. Карбоксилированные наноалмазы хранили под вакуумом или в токе азота, чтобы избежать поглощения воды. В водный раствор лизоцима добавляли подготовленные карбоксилированные наноалмазы, для лучшей сорбции процесс проводили при тщательном перемешивании с использованием шейкера в течение 2 ч, после чего смесь центрифугировали и промывали несколько раз дистиллированной водой. Доказательством сорбции белка на поверхность наноалмазов служила ИК-спектроскопия. Недостатком способа является многостадийность, длительность обработки наноалмазов и применимость для неширокого круга лекарственных препаратов.

Известен метод сорбции высокомолекулярных соединений на поверхность детонационных наноалмазов, используемый для разделения белков (Патент РФ №2352387, МПК B01J 20/02, от 19.07.2007). Однако в данном способе наноалмазы иммобилизованы на полисахаридной матрице, которую подвергают отмывке дистиллированной водой, обрабатывают устойчивым наноалмазным гидрозолем, имеющим концентрацию наноалмазных частиц 0,5-10,0 мас. %, и промывают водой. В качестве полисахаридной матрицы используют сефарозу 2В. Процесс проводят в хроматографической колонке. Концентрация наноалмазов в матрице составляет 8,2-12,0 мг на 1 мл сорбента. К сожалению, авторы данного патента описывают только использование полученного композита в качестве хроматографического сорбента. Кроме того, авторами описан способ иммобилизации наноалмазов на полисахаридной матрице, что позволяет получать лишь объемный материал.

Известен способ ионной функционализации наноалмазов (заявка US 2010/0239678, от 23.09.2010), заключающийся в предварительной гидратации поверхности наноалмазов дистиллированной водой с последующей обработкой 0,01 Μ KOH, для получения положительно заряженных катионов калия (K⁺) на поверхности наноалмазов. Далее на полученный материал предложено наносить отрицательные анионы (анионы персульфата), источником которых служит оксон. Полученные наноалмазы подвергают ионной функционализации положительно заряженными молекулами лекарственных препаратов. Указанным методом авторами были функционализированы наноалмазы молекулами амоксилина, 2-бром-2-нитропропан-1,3-диол, 3,5-диметилтетрагидро-1,3,5-2Н тиазин-2-тион, ацитромуцин, пенициллин и др.

Недостатком указанных способов является длительная обработка поверхности наноалмазов, многостадийность промывки образцов после каждой операции.

Наиболее близким к заявляемому способу, прототипом, является способ получения конъюгата наноалмаза с амикацином по патенту РФ №2476215 (МПК А61К 31/351, от 27.02.2012), в котором модифицированные хлором частицы наноалмаза растворяют в полярном растворителе с образованием суспензии, добавляют амикацина сульфат и третичный амин, полученную смесь обрабатывают ультразвуком с выдерживанием при 0-70°С с последующей промывкой растворителем, центрифугированием и сушкой. К недостаткам способа получения конъюгата наноалмаза с амикацином следует отнести его сложность, многостадийность, необходимость использования экологически вредных веществ и узкий спектр лекарств, доступных для конъюгирования.

Общими существенными признаками прототипа с заявляемым способом является получение суспензии наноалмазов и лекарственного средства растворением в органическом или водно-органическом растворителе, упаривание полученной суспензии и сушка.

Задачей данного изобретения является разработка способа иммобилизации молекул лекарственного препарата галодифа на поверхности детонационных наноалмазов, обладающего свойствами технологичности, безопасности и экологичности.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что способ не требует дополнительной подготовки поверхности детонационных наноалмазов при нанесении лекарственного вещества, а также использование полиэтиленгликолей - ПЭГов в качестве солюбилизирующих покрытий, позволяющее усилить эффективность способа путем усиления действия галодифа и увеличения продолжительности его воздействия.

Поставленная задача решается тем, что в способе иммобилизации галодифа на поверхность детонационных наноалмазов, основанном на получении суспензии детонационных наноалмазов и лекарственного препарата растворением в органическом или водно-органическом растворителе, последующем упаривании полученной суспензии лекарственного препарата с наноалмазами и сушке, качестве лекарственного препарата используют галодиф, при этом полученную суспензию галодифа и детонационных наноалмазов выдерживают при комнатной температуре в течение не менее 24 часов при интенсивном перемешивании, а иммобилизацию галодифа осуществляют на окисленную поверхность детонационных наноалмазов.

Целесообразно упаривать суспензию детонационных наноалмазов с галолдифом в органическом или водно-органическом растворителе на роторном испарителе при температуре не более 70°С и давлении в диапазоне 170-400 мбар.

Рационально суспензию детонационных наноалмазов с галодифом в органическом или водно-органическом растворителе после упаривания высушивать не менее 24 часов на воздухе при комнатной температуре.

Целесообразно наносить на поверхность детонационных наноалмазов с иммобилизированным галодифом солюбилизирующие покрытия.

Оптимально в качестве солюбилизирующих покрытий использовать полиэтиленгликоли, или фосфорилированные полиэтиленгликоли, или фосфолипиды.

Рационально наносить солюбилизирующее покрытие, получая суспензию из солюбилизирующего покрытия и детонационных наноалмазов с иммобилизованным галодифом растворением в органическом или водно-органическом растворителе, с последующим интенсивным перемешиванием, упариванием полученной суспензии и сушке.

Целесообразно суспензию из солюбилизирующего покрытия и детонационных наноалмазов с иммобилизированным галолдифом выдерживать в органическом или водно-органическом растворителе не менее 24 часов при интенсивном перемешивании.

Оптимально в качестве органического растворителя использовать низшие углеводороды, например гептан или гексан.

Рационально в качестве органического растворителя использовать низшие галогенуглеводороды, например дихлорметан или хлороформ.

Целесообразно в качестве водно-органического растворителя использовать водные растворы спиртов, например этанол, или метанол, или изопропанол.

Оптимально в качестве водно-органического растворителя использовать водные растворы кетонов, например ацетон, или метилэтилкетон.

Заявляемый способ обладает повышенным быстродействием и технологичностью, так как не требует дополнительной подготовки поверхности детонационных наноалмазов (например, фторированием или хлорированием) при нанесении галодифа, при этом достигается повышение безопасности и экологичности способа.

Использование ПЭГов в качестве солюбилизирующих покрытий позволяет усилить эффект действующего лекарственного вещества (галодифа) и увеличить продолжительность его действия.

На Фиг. 1 - представлен пример ИК-спектров детонационных наноалмазов (линия 1), галодифа (линия 2) и детонационных наноалмазов с иммобилизованным галодифом (сплошная линия 3).

Способ реализуют следующим образом.

Проводят суспендирование детонационных наноалмазов и галодифа в органическом или водно-органическом растворе, например, в хлороформе, или изопропиловом спирте, или изопропиловом спирте с водой, или ацетоне, или хлористом метилене. Процесс иммобилизации галодифа на поверхность окисленных детонационных наноалмазов осуществляют при комнатной температуре в течение одних суток при постоянном интенсивном перемешивании. Далее растворитель упаривают. Для нанесения солюбилизирующего покрытия наноалмазы с иммобилизованным галодифом суспендируются в органическом или водно-органическом растворе. Полученная суспензия выдерживается в течение суток, после чего упаривается в течение 2 часов на роторном испарителе при заданных температуре и давлении. Полученный материал дополнительно сушится на воздухе при комнатной температуре.

Реализация заявляемого способа подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Иммобилизация галодифа (1-[(3-хлорфенил)-фенил-метил]мочевина) на поверхности детонационных наноалмазов.

Галодиф (0,8 г) растворялся в 200 мл хлороформа. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавлялись наноалмазы (3,2 г). Полученный раствор оставлялся на 24 часа при интенсивном перемешивании. Полученная суспензия упаривалась на роторном испарителе при 60°С и давлении 175 мбар и высушивалась 24 часа на воздухе при комнатной температуре. Получено 4 г материала с содержанием галодифа 0,2 г/г композита.

Связывание галодифа и детонационных наноалмазов проходит за счет взаимодействия -CONH₂ группы с окисленной поверхностью детонационных наноалмазов.

Факт иммобилизации галодифа на поверхность детонационных наноалмазов фиксировался методом ИК-спектроскопии в сравнении с исходными образцами детонационных наноалмазов, появлением характеристических полос поглощения лекарственного препарата.

Связывание функциональных групп и окисленной поверхности детонационных наноалмазов подтверждается методом ИК-спектроскопии на примере галодифа. В случае иммобилизации молекул галодифа на поверхность детонационных наноалмазов в ИК-спектрах фиксируется сильное взаимодействие между -CONH2 группой галодифа и - ОН группами на поверхности окисленных детонационных наноалмазов. На Фиг. 1 приведен пример ИК- спектров детонационных наноалмазов (линия 1), галодифа (линия 2) и (сплошная линия 3) детонационных наноалмазов с иммобилизованным галодифом. В ИК-спектре наноконъюгата наблюдается существенное уширение и смещение полосы колебаний связей -NH2 (3250-4000 см-1) групп галодифа по сравнению с исходным галодифом. Широкая полоса колебаний обнаруживается в области 3700-3750 см^-1. Данный факт говорит о том, что взаимодействие молекул галодифа и поверхности детонационных наноалмазов реализуется в первую очередь при участии карбамидного фрагмента, что согласуется с теоретическими данными об образовании водородных связей [Бондарев А.А. Термодинамические основы фармакодинамики / А.А. Бондарев, И.В. Смирнов, В.В. Удут. - Томск, 2005. - 96 с].

Исходя из теоретических данных о прочностных характеристиках связей можно заключить, что заявляемый способ является более технологичным и быстродействующим, при этом позволяет увеличить прочность получаемых композитов по сравнению с нанесением лекарственных веществ на неокисленные поверхности препаратов.

Пример 2: Иммобилизация галодифа на поверхности наноалмазов. 0,2 г галодифа растворялся в 100 мл гексана. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавлялись наноалмазы (0,8 г). Полученный раствор оставлялся на 12 часов при интенсивном перемешивании. Полученная суспензия упаривалась на роторном испарителе при 60°С и давлении 100 мбар и высушивалась 24 часа на воздухе при комнатной температуре. Получено 1 г материала с содержанием лекарственного препарата 0,19 г/г. Иммобилизация ПЭГов на поверхности наноалмазов. 1.5 г ПЭГа 5000 растворяется в 250 мл смеси гексана и этанола в соотношении 10 к 1. К раствору ПЭГа добавлялось 0.5 г наноалмазов с иммобилизованным галодифом. Полученная суспензия выдерживалась в течение 24 часов и по истечении медленно упаривалась на роторном испарителе при температуре 50°С и давлении 374 мбар. Полученный материал дополнительно высушивался в вакуумном эксикаторе над щелочью в течение 18 часов.

Пример 3: Иммобилизация галодифа на поверхности наноалмазов. 0,2 г галодифа растворялся в 100 мл в этаноле. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавлялись наноалмазы (0,8 г). Полученный раствор оставлялся на 72 часа при интенсивном перемешивании. Полученная суспензия упаривалась на роторном испарителе при 60°С и давлении 100 мбар и высушивалась 24 часа на воздухе при комнатной температуре. Получено 1 г материала с содержанием лекарственного препарата 0,2 г/г.

Иммобилизация ПЭГов на поверхности наноалмазов с галодифом проводилась так же, как и в примере 2.

Пример 4: Иммобилизация галодифа на поверхности наноалмазов. 0,2 г галодифа растворялся в 100 мл ацетона. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавлялись наноалмазы (0,8 г). Полученный раствор оставлялся на 24 часа при интенсивном перемешивании. Полученная суспензия упаривалась на роторном испарителе при 60°С и давлении 100 мбар и высушивалась 12 часов на воздухе при комнатной температуре. Получено 1 г материала с содержанием лекарственного препарата 0,2 г/г и содержанием влаги 20%.

Иммобилизация ПЭГов на поверхности наноалмазов с галодифом проводилась так же , как и в примере 2.

Пример 5: Иммобилизация галодифа на поверхности наноалмазов. 0,2 г галодифа растворялся в 100 мл ацетона. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавлялись наноалмазы (0,8 г). Полученный раствор оставлялся на 24 часа при интенсивном перемешивании. Полученная суспензия упаривалась на роторном испарителе при 100°С и давлении 400 мбар и высушивалась 24 часов на воздухе при комнатной температуре. Получено 1 г материала с содержанием лекарственного препарата 0,2 г/г.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что концентрация иммобилизированного галодифа на поверхности детонационных наноалмазов составляет 0,2 г на грамм нанокомпозита без дополнительного солюбилизирующего покрытия и 0,1 г/г композита с дополнительным солюбилизирующим покрытием.

Как было показано в работе [Бондарев А.А. Термодинамические основы фармакодинамики / А.А. Бондарев, И.В. Смирнов, В.В. Удут. - Томск, 2005. - 96 с.], прочностные характеристики связывания с окисленной поверхностью детонационных наноалмазов, содержащих -ОН, -СООН, С=O группы, растут с увеличением полярности функциональных групп.

Таким образом, заявляемый способ иммобилизации галодифа на поверхность окисленных детонационных наноалмазов позволяет получить прочные конъюгаты детонационных наноалмазов с лекарственным веществом с высоким эффектом и продолжительностью действия наиболее быстро и технологично.