Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ГРИБА Aspergillus oryzae - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ПРОТЕИНАЗ И ПЕПТИДАЗ, НУКЛЕАЗ, ХИТИНАЗЫ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ, МАННАНАЗЫ И АЛЬФА-АМИЛАЗЫ

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности для получения комплексных препаратов протеиназ и пептидаз, нуклеаз, хитиназы, β-глюканазы, маннаназы и α-амилазы с целью дальнейшего их применения для глубокого гидролиза растительного, животного и микробного сырья при получении биокорректоров пищи и кормов, белково-аминокислотных добавок кормового и пищевого назначения, биологически активных добавок с функциональными свойствами. Штамм гриба Aspergillus oryzae 12-84 продуцирует комплекс гидролитических ферментов и депонирован в коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ГНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 01134.

Изобретение касается создания нового мутантного штамма гриба Aspergillus oryzae 12-84, используемого для получения комплекса протеиназ и пептидаз, нуклеаз, хитиназы, β-глюканазы, маннаназы и α-амилазы.

Штамм получен на основе известного промышленного штамма Aspergillus oryzae РОМ-156 (ВКПМ F-981) - продуцента протеаз путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза.

Изобретение обеспечивает получение высокоактивных комплексных ферментных препаратов протеолитического, нуклеазного, хитиназного, β-глюканазного и маннаназного действия в результате глубинного культивирования нового мутантного штамма на зерновых ферментационных средах.

Отличительной особенностью синтезируемого комплекса ферментов является широкая субстратная специфичность и способность гидролизовать высокомолекулярные полимеры не только растительного и животного сырья, но и осуществлять глубокий гидролиз микробного сырья, в том числе белковых веществ, нуклеиновых кислот и полисахаридов. Вследствие этого штаммы микроорганизмов, продуцирующие комплекс гидролаз, и получаемые на его основе комплексные ферментные препараты, катализирующие глубокий гидролиз полимеров растительного, животного и микробного происхождения, имеют широкие перспективы применения во многих отраслях биотехнологии и пищевой промышленности [1-3]. Применение ферментного препарата, полученного с использованием заявляемого штамма, позволяет осуществлять более глубокий гидролиз сельскохозяйственного сырья, увеличить выход и качество целевых продуктов, улучшить экологическое состояние перерабатывающих производств.

Наиболее характерное практическое применение комплексных препаратов протеолитического, нуклеазного, хитиназного, β-глюканазного и маннаназного действия связано с повышением эффективности биотехнологических процессов переработки высокомолекулярных полимеров микробной биомассы, в том числе дрожжевой биомассы - отхода бродильных производств, мицелиальной биомассы - отхода ферментной и микробиологической промышленности. Наличие в комплексе пептидаз, протеиназ, нуклеаз, хитиназы, β-глюканазы и маннаназы позволяет использовать ферментные препараты для глубокого гидролиза микробного сырья с целью получения биологически активных пищевых и кормовых добавок с различными структурно-функциональными свойствами.

Известны штаммы микроорганизмов - продуценты грибных протеаз из рода Aspergillus oryzae 251-90, 387 и 107 [4-6], при глубинном культивировании которых синтезируются кислые и слабокислые протеазы, ксиланазы и α-амилаза. Недостатками этих продуцентов является низкая продуктивность, узкий комплекс синтезируемых ферментов, отсутствие в составе комплекса нуклеаз, хитиназы, β-глюканазы и маннаназы.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Aspergillus oryzae РОМ-156, регистрационный номер ВКПМ F-981 [7], один из наиболее активных продуцентов протеаз и комплекса других гидролитических ферментов. В глубинной культуре известного штамма Aspergillus oryzae РОМ-156 протеолитическая активность достигает 28,0-39,0 ед. ПС/см³, β-глюканазы 4,1-4,8 ед. β-ГкС/см³.

Недостатком этого штамма является низкий уровень активности нуклеаз, хитиназ, β-глюканаз и маннаназ в культуральной жидкости (к.ж.) гриба.

Задачей изобретения является получение штамма гриба Aspergillus oryzae, обладающего высокой способностью к образованию комплекса протеиназ и пептидаз, нуклеаз, хитиназы, β-глюканазы и маннаназы.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма Aspergillus oryzae 12-84, заключается в получении комплексного ферментного препарата протеиназ и пептидаз, нуклеаз, β-глюканазы, маннаназы, уровень активности которых при глубинном и твердофазном культивировании превышает аналог: по нуклеазам - в 24-45 раз, по хитиназе - в 3,0-5,0 раз, по β-глюканазе - в 1,7-4,5 раза, по маннаназе - в 1,4-7,5 раза.

Сущность изобретения - новый мутантный штамм Aspergillus oryzae 12-84 - продуцент комплекса высокоактивных гидролаз: протеиназ и пептидаз, нуклеазы, хитиназы, β-глюканазы, маннаназы и α-амилазы.

Задача решается созданием нового штамма - продуцента комплекса гидролаз путем селекции и мутагенеза из известного штамма Aspergillus oryzae POM-156 [7], способного к росту на жидких или твердых простых по составу питательных средах и активному синтезу комплекса протеаз, нуклеаз, хитиназы, β-глюканазы, маннаназы и α-амилазы.

В результате мутагенеза после неоднократного отбора и рассева вариантов получен штамм Aspergillus oryzae 12-84 - продуцент комплекса протеиназ и пептидаз, α-амилазы с повышенной биосинтетической способностью по отношению к нуклеазам, хитиназе, β-глюканазе и маннаназе.

Изучали уровни продукции ферментативных комплексов заявляемого штамма Aspergillus oryzae 12-84 и известного штамма Aspergillus oryzae РОМ-156 при их глубинном и твердофазном культивировании путем выращивания на жидкой и твердой питательных средах. Общую протеолитическую активность определяли по ГОСТ Р 53974-2010, используя в качестве субстрата бычий гемоглобин при оптимальных условиях действия протеаз, нуклеазную активность определяли спектрофотометрическим методом по гидролизу денатурированной ДНК в течение 10 мин при 40°С, β-глюканазную активность - по ГОСТ Р 53973-2010, маннаназную активность - по методу Шомоди-Нельсона, амилолитическую активность - по ГОСТ 54330-2011. Сравнительные показатели уровней ферментативных активностей в культуре гриба Aspergillus oryzae 12-84 с прототипом представлены в табл.1 и 2.

Таким образом, в результате селекции и мутагенеза получен новый штамм Aspergillus oryzae 12-84, обладающий высоким уровнем синтеза комплекса протеиназ и пептидаз, нуклеаз, хитиназы, β-глюканазы и маннаназы, что позволяет повысить эффективность процесса получения комплекса ферментов при использовании штамма Aspergillus oryzae 12-84.

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры и на косяках с сусло-агаром в отделе биосинтетических и биокаталитических нанотехнологий ферментов, дрожжей, органических кислот и биологически активных веществ Государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии Россельхозакадемии г. Москвы.

Штамм Aspergillus oryzae 12-84 характеризуется следующими свойствами.

На 3 сутки роста на сусло-агаре размер колонии составляет 37×40 мм, обратная сторона гладкая, профиль колонии плоский, колонии пушистые, округлой формы, края ровные; цвет колонии - зеленый, по краю колонии белый пушистый мицелий. На 6 сутки роста диаметр колонии 80×82 мм.

При росте на агаризованной среде Чапека размер колонии через 6 суток 46×47 мм, цвет колонии коричнево-зеленый, форма колоний округлая, края ровные, белые, отмечается радиальная складчатость.

На всех средах наблюдается обильное спорообразование, пигменты в среду не выделяются, эксудата нет, слабый запах плесени.

Морфология штамма. Вегетативный мицелий септированный, хорошо разветвленный со вздутиями, толщина гиф 5-10 мкм; конидии формируются экзогенно, поверхность конидии гладкая, форма округлая, диаметр спор 4-5 мкм; образует конидиальные головки с одноярусными стеригмами. Конидиеносцы булавидной формы, на них располагаются параллельно друг к другу кеглеобразные стеригмы, на которых находятся конидии.

Физиолого-биохимическая характеристика. Тип катаболизма - дыхание. Отношение к кислороду - аэроб. Оптимальная температура роста 30-32°С, максимальная 50°С, минимальная 18°С. Оптимальное значение рН среды для роста гриба и биосинтеза ферментов 5,4; рост продуцента имеет место в зоне рН от 2,5 до 10,0.

В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин, галактозу. Продуцент ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки.

Штамм непатогенный.

Штамм Aspergillus oryzae 12-84 предназначен для получения комплекса протеаз, нуклеаз, хитиназ, β-глюканаз, маннаназы и α-амилазы.

При глубинном культивировании штамма Aspergillus oryzae 12-84 протеолитическая активность составляет 30,7 ед. ПС/см³, нуклеазная - 4,8·10^-3 ед. НС/см³, хитиназная - 0,21 ед. ХС/см³, β-глюканазная - 6,8 ед. β-ГкС/см³, маннаназная - 0,82 ед. МС/см³, амилолитическая - 12,0 ед. АС/см³ (табл.1).

При выращивании штамма Aspergillus oryzae 12-84 на пшеничных отрубях с влажностью 54% уровень протеолитической активности составляет 158,7 ед. ПС/г, нуклеазной - 36,0·10^-3 ед. НС/г, хитиназной - 1,74 ед. ХС/г, β-глюканазной - 46,4 ед. β-ГкС/г, маннаназной - 12,7 ед. МС/г, амилолитической - 123,0 ед. АС/г (табл.2).

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Aspergillus oryzae 12-84 и штамм Aspergillus oryzae РОМ-156 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; KH₂PO₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный. Ферментационную питательную среду засевают вегетативным посевным материалом каждой культуры гриба в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 ч. Глубинное культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см³ питательной среды, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 30-32°С в течение 48 ч. Максимальный уровень нуклеазной, хитиназной, β-глюканазной и маннаназной активности ферментов наблюдался у заявляемого штамма Aspergillus oryzae 12-84 и составил: 4,8·10^-3 ед. НС/см³, 0,21 ед. ХС/см³, 6,08 ед. β-ГкС/см³ и 0,82 ед. МС/см³ соответственно (табл.1).

Пример 2. Штамм Aspergillus oryzae 12-84 и штамм Aspergillus oryzae РОМ-156 культивируют на твердой питательной среде следующего состава, %: отруби пшеничные с влажностью 54%. Ферментационную питательную среду засевают водной суспензией спор каждой культуры гриба в количестве 4%. Твердофазное культивирование гриба осуществляют в конических колбах объемом 250 см³, содержащих 50 г питательной среды, в стационарных условиях при температуре 30-32°С в течение 3 суток. Максимальный уровень протеолитической, нуклеазной, хитиназной, β-глюканазной и маннаназной активности ферментов наблюдался у заявляемого штамма Aspergillus oryzae 12-84 и составил: 158,7 ед. ПС/см³, 36,0·10^-3 ед. НС/см³, 0,21 ед. ХС/см³, 1,74 ед. β-ГкС/см³ и 12,7 ед. МС/см³ соответственно (табл.2).

Источники информации

1. Римарева Л.В. Биотехнологические аспекты создания пищевых добавок биокоррегирующего действия на основе микробной биомассы / Л.В. Римарева, Е.И. Курбатова, Е.Н. Соколова, Н.А., Фурсова, А.В. Макарова // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2011. - №2. - С.45-47.

2. Римарева Л.В. Использование биомассы гриба Aspergillus oryzae в качестве источника биологически активных веществ / Л.В. Римарева, Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, К.В. Рачков, Е.В. Орлова, И.М. Абрамова // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2012. - №9. - С.46-50.

3. Римарева Л.В. Эффективный ферментный препарат протеолитического и гемицеллюлазного действия для перерабатывающих отраслей АПК/ Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Е.М. Серба, К.Л. Агашичева // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2010. - №4. - С.14-16.

4. Зуева Р.В. Физиолого-биохимические исследования экспериментально полученного мутанта Aspergillus oryzae - активного продуцента кислой протеиназы. Автореферат канд. диссертации. - М.: 1971.

5. Патент РФ 2070921, кл. C12N 1/14, 1993.

6. Патент РФ 2315098, кл. C12N 1/14, 2006.

7. Патент РФ 2315096, кл. C12N 1/14, 2006.