НАБОР ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ЗОНДОВ ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ Burkholderia mallei МЕТОДОМ АМПЛИФИКАЦИИ ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХ ФРАГМЕНТОВ ДНК

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии и может быть использовано для детекции результатов амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК при типировании возбудителя сапа специалистами референс-центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней, национальных центров верификации диагностической деятельности, а также научно-исследовательских организаций эпидемиологического и микробиологического профиля.

Can - тяжелое антропозоонозное инфекционное заболевание, характеризующееся септицемией, образованием специфических гранулем, абсцессов в органах и тканях и высокой летальностью. Возбудитель сапа, Burkholderia mallei, отнесен к категории В потенциальных агентов биотерроризма центром по контролю и профилактике заболеваний США.

Необходимость исследований, направленных на диагностику и типирование штаммов В. mallei, связана с сохранением угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций, возможных террористических актов с использованием этого возбудителя. Генотипирование В. mallei, основанное на определении различий геномов штаммов данного вида, направлено на расследование вспышек, мониторинг природных очагов сапа, геномную паспортизацию и определение филогенетических связей штаммов.

Для типирования возбудителя сапа применяются различные молекулярно-генетические подходы. Однако мультилокусное сиквенс-типирование оказалось неэффективным для высококонсервативного генома В. mallei [Godoy D., Randle G., Simpson A.J. et al. Multilocus sequence typing and evolutionary relationships among the causative agents of melioidosis and glanders, Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei / J. Clin. Microbiol. 2003; 41(5):20б8-79]. ПЦР со случайными праймерами, показав высокую дискриминирующую способность, характеризовалась низко и межлабораторной воспроизводимостью [Антонов В.А., Алтухова В.В., Савченко С.С., Замараев B.C., Илюхин В.И., Алексеев В.В. Использование мультилокусного сиквенс-типирования (MLST) и амплификации с произвольными праймерами (RAPD) для дифференциации штаммов возбудителя сапа/Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2007; 3:3-9]. Большинство методов генотипирования включают обязательный этап постановки элекрофореза для детекции результатов, что увеличивает время проведения анализа.

Типирование на основе амплификации дифференцирующих фрагментов генома - DFR-анализ (different region), заключается в серии полимеразных цепных реакций с праймерами, фланкирующими вариабельные фрагменты ДНК-мишеней, присутствующих только у определенных штаммов. Для проведения реакций амплификации при DFR-типировании используются олигонуклеотидные праймеры, специфические для определенных штаммов возбудителя сапа. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на границах дифференцирующих фрагментов и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор дифференцирующего фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микроорганизмов.

Детекция продуктов амплификации с использованием специальных флуоресцентных меток позволит отказаться от стадии электрофореза, что не только сократит время проведения анализа, но и снизит риск перекрестной контаминации продуктами ПЦР и, соответственно, уменьшит риск ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе реакции амплификации, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории силами одного сотрудника. Этот подход позволит проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимет проблему субъективно и оценки электрофореграмм. Существует несколько флуоресцентных технологий, различающихся по способам генерации репортерной флуоресценции. В данном изобретении предлагаются зонды с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярных маяков».

Наиболее близким аналогом изобретения является схема генотипирования с использованием амплификации дифференцирующих фрагментов для возбудителя мелиоидоза, предложенная Kwanjit Duangsonk с соавторами в 2006 г. [Use of a Variable Amplicon Typing Scheme Reveals Considerable Variation in the Accessory Genomes of Isolates of Burkholderia pseudomallei, Kwanjit Duangsonk, Daniel Gal, Mark Mayo, C. Anthony Hart, Bart J. Currie, and Craig Winstanley]. Однако данная схема не эффективна для типирования возбудителя сапа, в ней также не разработана флуоресцентная детекция результатов.

Целью настоящего изобретения является разработка набора флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов для детекции результатов DFR-типирования штаммов возбудителя сапа методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов, имеющих структуру «шпильки» с флуорофором и гасителем флуоресценции на концах и обладающих комплементарностью к дифференцирующим фрагментам генома В. mallei:

BmVATIp 5′(ROX)-CCGCGAGCACGCTCTCGACCGAGCGCACGCGG-(BHQ2)3′,

комплементарный фрагменту локуса ВМА0577 генома В. mallei ACTC 23344, фланкированному праймерами BmVAT1-Ch1s/BmVAT1-Ch1as;

BmVAT2p 5′ (FAM)-CGCGCTCGCCGCCTATCCGCTCGTGCTGCGCG-(BHQ 1)3′, комплементарный фрагменту локуса ВМА0958 генома В. mallei ACTC 23344, фланкированному праймерами BmVAT2-Ch1s/BmVAT2-Ch1as;

BmVAT3p 5′(ROX)-ACAGCGTCGTCGACGACCGCGGGCCGCTCT-(BHQ2)3′, комплементарный фрагменту локуса ВМА2089 генома В. mallei ACTC 23344, фланкированному праймерами BmVAT3-Ch1s/BmVAT3-Chlas;

BmVAT4p 5′(HEX)-ACGTCGCGCCCCGCGCCGCAACCGACGT-(BHQ2)3′, комплементарный фрагменту локуса ВМА2262 генома В. mallei ACTC 23344, фланкированному праймерами BmVAT4-Ch1s/BmVAT4-Chlas;

BmVAT5p 5′(HEX)-CCCGAATTTCTCGCGCTCAATCCGTTCGGG-(BHQ2)3′, комплементарный фрагменту локуса ВМАА0107 генома В. mallei ACTC 23344, фланкированному праймерами BmVAT5-Ch2s/BmVAT5-Ch2as;

BmVAT6p 5′(Cy5)-ACCGAGTTAGTTCCGTTCCTTCGGT-(BHQ2)3′, комплементарный фрагменту локуса ВМАА0416 генома В. mallei ACTC 23344, фланкированному праймерами BmVAT6-Ch2s/BmVAT6-Ch2as;

BmVAT7p 5′(HEX)-CTTGCCTACATCATCGAAAAGCTGGGCAAG-(BHQ2)3′, комплементарный фрагменту локуса ВМАА0871 генома В. mallei ACTC 23344, фланкированному праймерами BmVAT7-Ch2s/BmVAT7-Ch2as;

BmVATSp 5′(ROX)-CCGCGATGCTGGTTTGCATGCGCCGCCGCGG-(BHQ2)3′, комплементарный фрагменту локуса ВМА10247_А0137 генома В. mallei NCTC 10247, фланкированному праймерами BmVAT8-Ch2s/BmVAT8-Ch2as;

BmVAT9p 5′(Cy5)-CGATCGCTGTATTCCATGCCGTCGATCG-(BHQ2)3′, комплементарный фрагменту локуса ВМА10247_А1008 генома В. mallei NCTC 10247, фланкированному праймерами BmVAT9-Ch2s/BmVAT9-Ch2as;

где:

FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 492 нм, а длина волны флуоресценции 520 нм. HEX - флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 535 нм, а длина волны флуоресценции 556 нм. ROX - карбокси-Х-родамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 580 нм, а длина волны флуоресценции 605 нм. Cy5 - флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 649 нм, а длина волны флуоресценции 670 нм. BHQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 480-580 нм. BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.

Характеристика флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов и ДНК-мишеней для их гибридизации.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), были подобраны олигонуклеотиды по типу «молекулярного маяка», обладающие активностью гибридизационных зондов к фрагментам генома возбудителя сапа, фланкированным праймерами BmVAT1-Ch1s/BmVAT1-Ch1as, BmVAT2-Ch1s/BmVAT2-Ch1as, BmVAT3-Ch1s/BmVAT3-Ch1as, BmVAT4-Ch1s/BmVAT4-Ch1as, BmVAT5-Ch2s/BmVAT5-Ch2as, BmVAT6-Ch2s/BmVAT6-Ch2as, BmVAT7-Ch2s/BmVAT7-Ch2as, BmVAT8-Ch2s/BmVAT8-Ch2as, BmVAT9-Ch2s/BmVAT9-Ch2as. Характеристика набора зондов и соответствующие мишени в геноме В. mallei приведены в таблице 1.

Апробация зондов была осуществлена на наборе штаммов возбудителя сапа коллекционного центра ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. Было продемонстрировано, что разработанный набор гибридизационных зондов может быть использован для флуоресцентной детекции продуктов амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК возбудителя сапа, что позволяет определять генетический профиль исследуемых штаммов В. mallei. Данный подход отличается легкостью детекции, использованием стандартного оборудования для проведения ПЦР и быстротой получения результата.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Алгоритм конструирования флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов для типирования штаммов возбудителя сапа методом амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК.

На основе анализа in silico нуклеотидных последовательностей фрагментов дифференциации возбудителя сапа, фланкированных праймерами BmVAT1-Ch1s/BmVAT1-Ch1as, BmVAT2-Ch1s/BmVAT2-Ch1as, BmVAT3-Ch1s/BmVAT3-Ch1as, BmVAT4-Ch1s/BmVAT4-Ch1as, BmVAT5-Ch2s/BmVAT5-Ch2as, BmVAT6-Ch2s/BmVAT6-Ch2as, BmVAT7-Ch2s/BmVAT7-Ch2as, BmVAT8-Ch2s/BmVAT8-Ch2as, BmVAT9-Ch2s/BmVAT9-Ch2as, с помощью программы UGENE v1.5. (Унипро, Россия) сконструированы гибридизационные зонды (таблица).

Полученные олигонуклеотиды были проанализированы с помощью компьютерной программы Vector NTI Express v.1.1.2 (Life Technologies, США) на предмет образования вторичных структур с соответствующими праймерами, и показана их теоретическая пригодность для успешной флуоресцентной детекции результатов реакций амплификации.

Пример 2. Детекция продуктов амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК с помощью разработанного набора зондов для типирования штаммов возбудителя сапа.

Материалом для исследования являлись чистые культуры возбудителя сапа, предварительно идентифицированные до вида. Обеззараживание исследуемых проб проводили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,01% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С (МУ 4.2.2831-11 Лабораторная диагностика сапа). Выделение ДНК из чистых культур возбудителя сапа осуществляли с помощью метода лизиса гуанидинизотиоцианатом и переосаждения ДНК с изопропанолом («АмплиПрайм РИБО-преп», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).

В состав реакционных смесей, помимо анализируемой ДНК, входили комплементарные дифференцирующим фрагментам ДНК В. mallei олигонуклеотидные зонды, прямой и обратный праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент ДиаТак-полимераза (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Амплификацию продолжительностью 45 циклов проводили в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта», который обеспечивался прослойкой воска.

Анализ продуктов ПНР осуществляли в режиме реального времени на приборе «DT Lite» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», Россия). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме. Результат амплификации каждого DFR фрагмента считался положительным, в случае если кривая накопления флуоресценции по заданному каналу пересекала пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции, на цикле, не превышающем граничное значение Ct (рис.1.). Рисунок 1 отображает график нарастания флуоресцентных кривых, полученных при амплификации ДНК штаммов возбудителя сапа с праймерами BmVAT3-Ch1s/BmVAT3-Ch1as (1 - В. mallei Muksuwar - 11, 2 - В. mallei Zagreb, 3 - В. mallei Bogor - 37).

Пример 3. Анализ результатов типирования штаммов возбудителя сапа из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора методом амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК с детекцией в реальном времени.

Для составления генетического профиля исследуемых штаммов В. mallei проводили амплификацию по девяти DFR-локусам с детекцией в реальном времени с помощью разработанного набора зондов. Для дальнейшего анализа результаты ПЦР конвертировали в двоичную матрицу, в которой наличие ампликона обозначалось «1I», а его отсутствие - «0».

Затем с помощью компьютерных программ провели сравнение DFR-паттернов 14 коллекционных штаммов возбудителя сапа с DFR-типами 4 аннотированных штаммов из GeneBank, определенными in silico. Кластерный анализ провели с использованием метода Neighbor-Joining и категорического коэффициента. Результатом обработки данных DFR-анализа являлась дендрограмма, изображенная на рисунке 2, отображающая генетические расстояния или эволюционные взаимоотношения между исследуемыми штаммами. Применение данного подхода позволило разделить 18 исследуемых штаммов В. mallei на 11 генотипов.

Таким образом, разработанный набор гибридизационных зондов может быть использован для флуоресцентной детекции результатов типированкя возбудителя сапа методом амплификации дифференцирующих фрагментов генома. Данный подход обеспечивает возможность одновременного анализа девяти DFR-локусов, характеризуется легкостью интерпретации, быстротой получения результата, использованием стандартного оборудования и будет полезен в осуществлении эпидемиологического надзора за сапной инфекцией.