Результат интеллектуальной деятельности: ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ BURK1526S/BURK1526AS ДЛЯ ОЦЕНКИ АДАПТАЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ГЕНОМА ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано для научных исследований при изучении адаптационной изменчивости генома штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, культивированных при различных условиях на питательных средах и пассированных на лабораторных животных.

Возбудитель сапа (Burkholderia mallei) и возбудитель мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) - аэробные грамотрицательные неферментирующие бактерии, принадлежащие к роду Burkholderia. Мелиоидоз - эндемичное для Австралии и ряда стран Юго-Восточной Азии инфекционное заболевание людей и животных. Сап - особо опасная зоонозная инфекция. При этом штаммы патогенных буркхольдерий, пассированные в организме млекопитающих, как правило, обладают более высокой вирулентностью по сравнению с культивированными на питательных средах.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является прямым методом выявления определенных фрагментов ДНК и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК-комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных фрагментов генома микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск определенных локусов. В данном случае искомым фрагментом ДНК является участок генома возбудителей сапа и мелиоидоза, нуклеотидная последовательность которого изменяется после пассажей в организме млекопитающих.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера с заданной последовательностью. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПНР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа.

Наиболее близким аналогом являются специфичные праймеры, фланкирующие тандемные повторы В. pseudomallei, предложенные J.M. U′Ren с соавторами в 2007 г. [Tandem repeat regions within the Burkholderia pseudomallei genome and their application for high resolution genotyping. JM U′Ren, JM Schupp, Т Pearson, H Hornstra, CL Friedman, KL Smith, RR Daugherty, SD Rhoton, В Leadem, S Georgia, M Cardon, LY Huynh, D DeShazer, SP Harvey, R Robison, D Gal, MJ Mayo, D Wagner, BJ Currie, and P Keim. BMC Microbiol, Jan 2007; 7:23.] Однако данные праймеры и фланкируемые ими тандемные повторы обеспечивают только внутривидовую дифференциацию В. pseudomallei и не выявляют различий генома у штаммов, культивированных при различных условиях на питательных средах и пассированных на лабораторных животных.

Целью настоящего изобретения является получение высокоспецифичных праймеров для амплификации фрагмента генома В. mallei и В. pseudomallei, последовательность которого изменяется при различных условиях культивирования и после пассажей в организме млекопитающих.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов, фланкирующих гипервариабельный локус ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза ВМАА1526 (В. mallei ATCC 23344), обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации и имеющих следующую структуру:

5′-TGTCTTCGCCTTCGTTTGC-3′ - Burk1526s

5′-GCGACGACGGTGGCAAAGC-3′ - Burk1526as

Характеристика олигонуклеотидных праймеров и участка амплифицируемой ДНК

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), были подобраны праймеры, обозначенные Burk1526s/Burk1526as, комплементарные фрагменту локуса ВМАА1526 В. mallei и В. pseudomallei и фланкирующие тандемный повтор, кратный 12 парам оснований. Расчетная длина специфического фрагмента составляла 378 п.н.

Эксперименты проводили на музейных штаммах В. mallei и В. pseudomallei (из коллекционного центра музея живых культур ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора) как исходных, так и выделенных из экспериментально зараженных животных (белые мыши) на 4-е и 20-е сутки заражения.

После проведения ПЦР полученные ампликоны были секвенированы и проанализированы с использованием специализированного программного обеспечения. В результате проведенного исследования установлено, что после пассажей на экспериментально зараженных животных в локусе ВМАА1526 ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью праймеров Burk1526s/Burk1526as выявляется делеция, соответствующая одному нуклеотидному повтору (рис.2).

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для изучения адаптационной изменчивости генома патогенных буркхольдерий

На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителей сапа мелиоидоза, присутствующих в базах данных сети Интернет (EMBL, Genbank, DDBJ), для конструирования праймеров была выбрана последовательность локуса ВМАА1526 В. mallei АТСС 23344, размер которого составляет 513 п.н.. Данный локус кодирует белок ВарА (GenBank NCBI, GeneID:3086893) и содержит в своем составе тандемные повторы из 12 пар оснований. Аналогичная последовательность нуклеотидов обнаружена также в геноме В. pseudomallei. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами - 378 п.н.

При подборе праймеров руководствовались общими требованиями к олигонуклеотидным затравкам, используемым в ПЦР. При использовании компьютерных программ была проанализирована структура выбранных пар праймеров на предмет образования димеров, шпилек и других вторичных структур и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров для изучения адаптационной изменчивости генома патогенных буркхолдерий

В состав реакционных смесей помимо анализируемой ДНК входили праймеры Burk1526s/Burk1526as, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-полимераза. Для предупреждения испарения в процессе амплификации на мультициклере «Терцик» на поверхность смеси наслаивали 20 мкл минерального масла.

Амплификацию продолжительностью 40 циклов (денатурация ДНК при 94°С - 30 с, отжиг праймеров 64°С - 30 с, элонгация цепи при 72°С - 45 с) проводили в микроцентрифужных пробирках (0,5 мл) на мультициклере «Терцик» в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта», который осуществлялся разделением нуклеотидов и праймеров от ДНК-пробы и Taq-полимеразы прослойкой воска.

После этого продукты реакции разделяли при помощи электрофореза в 3% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса. При использовании разработанного набора праймеров в реакции амплификации с ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза синтезируемые ампликоны по электрофоретической подвижности соответствовали расчетным данным у штаммов, культивированных на питательных средах, и имели небольшие различия у штаммов, пассированных на лабораторных животных.

На рис. 1 изображена электрофореграмма продуктов амплификации вариабельного фрагмента локуса BMAA1526 патогенных буркхольдерий с помощью праймеров Burk1526s/Burk1526as, где дорожки 1 и 3 - исходные штампы B. pseudomallei, а 2 и 4 - выделенные после пассажей на лабораторных животных. Пятая дорожка электрофореграммы представляет собой маркер молекулярных размеров (леддер 100-1000 п.н.). Это подтверждает дифференцирующую способность сконструированных олигонуклеотидов при изучении адаптационной изменчивости генома В. mallei и В. pseudomallei.

Это подтверждает дифференцирующую способность сконструированных олигонуклеотидов при изучении адаптационной изменчивости генома В. mallei и В. pseudomallei.

С целью установления генетических изменений, происходящих в вариабельном локусе ВМАА1526, провели секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК штаммов возбудителя мелиоидоза. Для сравнения полученных нуклеотидных последовательностей использовали фрагменты генов штаммов В. mallei ATCC 23344 и В. pseudomallei K96243 из базы данных GeneBank. Реакцию секвенирования осуществляли при помощи набора Big-Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies, США) в объеме 10 мкл на амплификаторе GeneAmp PCR System 2700 (Life Technologies, США). Неинкорпорированные дНТФ удаляли переосаждением этанолом. Учет результатов проводили при помощи генетического анализатора ABI Prism 3130. Анализ полученных последовательностей осуществляли при помощи программного пакета UGENE v1.11.5 (Unipro, Россия).

В результате проведенного анализа секвенированных последовательностей локуса ВМАА1526 у штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, пассированных на лабораторных животных, обнаружена делеция, соответствующая одному тандемному повтору.

Таким образом, использование разработанных праймеров позволяет выявлять изменения генома штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, культивированных при различных условиях на питательных средах и пассированных на лабораторных животных.