Результат интеллектуальной деятельности: ПРОТИВОПАРАЗИТАРНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ АЛЬБЕНДАЗОЛА И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕЛЬМИНТОЗОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, в частности к лечению кишечных гельминтозов млекопитающих.

Гельминтозы животных распространены от арктических широт до экватора и опасны тем, что могут заразить и человека [1. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни. - М.: Медицина, 2001. - 1225 с.]. Гельминтами заражено более миллиарда человек. По числу больных заражение кишечными гельминтами занимает третье место в мире. По данным ВОЗ, общее число заболеваний и смертей от кишечных гельминтозов выше, чем от бактериальных, вирусных инфекций и других паразитарных болезней, вместе взятых. Около 2% населения России заражено кишечными гельминтозами, в южных районах страны зараженность достигает 7-10%. В ряде случаев лечение при паразитарных болезнях недостаточно эффективно и приводит к тяжелым последствиям - истощению иммунной системы и возникновению вторичного иммунодефицита, нарушениям механизмов гомеостаза, возникновениям аритмий, нарушениям психики, образованиям опухолей, в том числе злокачественных. Поэтому профилактика и лечение гельминтозов - одна из наиболее актуальных задач современной медицины и ветеринарии.

Ассортимент антигельминтных препаратов весьма обширен и базируется на субстанциях из различных классов органических соединений. Так, известны антигельмитные препараты из класса бензимидазолкарбаматов (медамин, альбендазол, фенбендазол), рекомендованные для профилактики цестодозов и нематодозов [2. Методические указания «Диагностика, лечение и профилактика гельминтозов и заболеваний, вызываемых кишечными простейшими». - М.: Медицина, 2004. - 82 с.; Тумольская Н.И. Альбендазол - новые возможности лечения гельминтозов // Новые лекарства. - 2003. - №4].

Для борьбы с гельминтозами животных широко применяют альбендазол (АБЗ) и его лекарственные формы [3. Архипов И.А. Антигельминтики: фармакология и применение. - М.: Россельхозакадемия, 2009. - 405 с.]. Препарат, обладая широким спектром действия, в том числе против нематод, цестод и трематод, успешно используют для лечения гельминтозов на разных видах животных, и особенно, жвачных. АБЗ эффективен против нематод, в том числе, и преимагинальных стадий. Эффективность его против нематодирусов, буностом, стронгилоидов и трихоцефал несколько ниже. АБЗ снижает зараженность животных имагинальными фасциолами, но не активен против молодых трематод [4. Bradley R.E., Randell W.F., Armstrong D.A. Efficiency of albendazole against Fasciola hepati-ca // Amer. J. Vet. Res. - 1981. - V. 42, №8. - P. 1062-1064]. Аналогичная картина отмечена и в отношении мониезий и гнатостом.

АБЗ проявил высокую активность и при лечении человека. Так, АБЗ в дозе 400 мг 3 сут подряд был испытан на 870 пациентах при различных гельминтозах и показал 81-100%-ную эффективность [5. Rossignol J.F., Maisonneuve H. // Ann. Trop. Med. Parasitol. - 1984. - V. 78, N1. - P. 135-144].

Недостатком АБЗ является необходимость использовать его в относительно высоких дозах и зачастую увеличивать длительность приема препарата из-за плохой растворимости в воде и физиологических средах [6. Тумольская Н.И. Альбендазол - новые возможности лечения гельминтозов // Новые лекарства. - 2003. - №4]. Вследствие низкой водорастворимости, эффективность препарата не достигает теоретически возможной.

Известен способ увеличения биодоступности альбендазола за счет увеличения кислотности желудочной среды. Однако такой путь физиологически неприемлем, так как высокая кислотность среды ЖКТ вызывает нарушение процесса пищеварения, изжогу, способствует эрозивным повреждениям стенки желудка. [7. N. Kohri, Y. Yamayoshi, К. Iseki, N. Sato, S. Todot, К. Mmiyazaki. Effect of Gastric pH on the Bioavailability of Albendazole in Rabbits // Pharm. Pharmacol. Commun. - 1998. - V. 4. - P. 267-270].

Известен способ увеличения растворимости альбендазола путем распылительной сушки твердых дисперсий альбендазола с различными полимерами - гидроксипропилметилцеллюлозой, поливиниловым спиртом, поливинилпирролидоном. Также аналогом нашего изобретения является работа [8. F.K. Alanazi, М. El-Badry, М.О. Ahmed. Improvement of Albendazole Dissolution by Preparing Microparticles Using Spray-Drying Technique // Sci. Pharm. - 2007. - V. 75. - P. 63-79]. Недостатком этого аналога является небольшая величина увеличения растворимости - до ~5 раз, а также довольно сложный процесс получения твердых дисперсий.

Известно техническое решение для получения и исследования биодоступности комплексов альбендазола с бетациклодекстрином. [9. С. Moriwaki, G.L. Costa, C.N. Ferra-cini, F.F. de Moraes, G.M. Zanin, E.A.G. Pineda, G. Matioli. Enhancement of solubility of albendazole by complexation with cyclodextrin // Brazilian Journal of Chemical Engineering. - 2008. - V. 25, №02. - P. 255-267]. Несмотря на достигнутое увеличение водорастворимости (до ~53 раз) и биодоступности, фармацевтическое применение данного технического решения практически затруднено вследствие действующих ограничений по величине рекомендованных/разрешенных для приема человеком доз циклодекстрина - не более 5 мг/кг [10. http://www.accessdata.fda.gov/scripts/fcn/gras_notices/214655A.PDF].

Наиболее близким техническим решением, выбранным за прототип противопаразитарному средству на основе альбендазола, является антигельминтный препарат на основе альбендазола и его межмолекулярных комплексов с водорастворимыми полимерами, получаемый в мельницах ударно-истирающего действия [11. С.С. Халиков, М.С. Халиков, Е.С. Метелева, С.А. Гуськов, В.И. Евсеенко, А.В. Душкин, B.C. Буранбаев, Р.Г. Фазлаев, В.З. Галимова, A.M. Галиуллина. Механохимическая модификация антигельминтных препаратов // Химия в интересах устойчивого развития. - 2011. - Т. 19, №6. - С. 699-703]. Этот препарат обладает повышенной растворимостью в воде и получен способом, аналогичным заявляемому противопаразитарному средству. Недостатком этого известного технического решения является то, что полученный в прототипе антигельминтный препарат не исследовался на предмет его биологического действия - антигельминтной активности. В указанном прототипе определена только принципиальная возможность повышения водорастворимости действующего вещества - альбендазола. Кроме этого, не проводилось исследований по выработке количественного критерия меры механической энергии при механохимическом получении препаратов альбендазола, что затрудняет переход между различными типами мельниц, а также масштабирование процесса до промышленных масштабов производства, что, соответственно, влияет на качество получаемого продукта.

Наиболее близким техническим решением, выбранным за прототип способа лечения кишечных гельминтов млекопитающих с использованием заявляемого противопаразитарного средства на основе альбендазола, являются свойства официнальных (базовых) препаратов альбендазола [12. Архипов И.А. Антигельминтики: фармакология и применение. - М. - 2009. - с. 148-158], где приводятся данные об использованных дозировках этого действующего вещества при лечении гельминтозов млекопитающих. Эти величины колеблются в диапазоне 5-75 мг/кг живого веса и зависят от вида гельминтов и состава/технологии получения антигельминтных средств.

Задача, решаемая заявляемым нами техническим решением, заключается в создании нового высокоактивного противопаразитарного средства, а также способа лечения кишечных гельминтозов млекопитающих с его использованием.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в заявляемом противопаразитарном средстве на основе альбендазола, включающем межмолекулярные комплексы альбендазола с водорастворимыми физиологически приемлемыми полимерами - арабиногалактаном из древесины лиственницы (АГ), гидроксиэтилкрахмалом (ГЭК) и поливинил-пирролидоном (ПВП), массовые соотношения альбендазола к водорастворимым полимерам составляют 1:5-20.

Поставленная задача решается также благодаря тому, что в заявляемом способе лечения гельминтозов млекопитающих с использованием противопаразитарного средства путем перорального введения его, используют противопаразитарное средство по п. 1 и вводят его в дозе не более 1 мг/кг живого веса.

Отличительной особенностью нашего изобретения является то, что на находящихся в среде ЖКТ млекопитающих паразитов фармакологический эффект оказывают не свободные молекулы альбендазола, а его комплексы с полимерами. При этом мольные концентрации комплексов многократно превышают концентрацию свободных молекул альбендазола в ~10¹-10² раз. И именно они оказывают повышенное фармакологическое действие, обнаруженное нами и позволяющее значительно понизить действующие лекарственные дозы альбендазола и его острую токсичность (см. Примеры реализации).

Для получения межмолекулярных комплексов использована механохимическая технология, заключающаяся в обработке смеси твердых компонентов интенсивными механическими воздействиями - давлением и сдвиговыми деформациями, реализуемые преимущественно в различного типа мельницах, осуществляющих ударно-истирающие воздействия на вещества. Смесь альбендазола (АБЗ) и полимеров, взятых в массовых соотношениях, равных 1:5-20, подвергают механической обработке в шаровых мельницах. Выбранные нами дозы механической энергии при механохимическом получении комплексов позволяют значительно повысить их стабильность (прочность комплексообразования) (см. Пример 1) и, как следствие, обуславливают их повышенную биологическую активность: антигельминтное действие, а также пониженную токсичность (см. Примеры 2-6). Целесообразно использовать массовые соотношения АБЗ: полимеры, равные 1:5-20, соответственно. При увеличении относительного содержания АБЗ в композициях количество образующихся комплексов, определяемое по увеличению водорастворимости, недостаточно для усиления биологической активности. При понижении содержания АБЗ в композициях они оказываются «перегружены» вспомогательными веществами - полимерами, что приводит к нежелательному увеличению общего веса дозы препарата, а также к увеличению его себестоимости.

В примерах реализации изобретения показано, что именно межмолекулярные комплексы АБЗ с арабиногалактаном, гидроксиэтилкрахмалом и ПВП обладали ~100%-ной антигельминтной активностью (против нематод и цестод) при сокращении дозировки АБЗ в 10 раз. Проведенный патентный поиск позволил установить, что аналогичных составов, обладающих нематодоцидной и цестодоцидной активностью, не обнаружено. Примененное авторами техническое решение об использовании АБЗ в виде его межмолекулярных комплексов как фармакологически действующих соединений не следует с очевидностью из приведенных аналогов и прототипа. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Заявляемые препараты в виде сухих композиций могут легко смешиваться с равным количеством или избытком вспомогательных веществ из классов фармакологически нейтральных моно-, ди- и полисахаридов для облегчения смачиваемости при суспендировании/растворении в водных растворах для последующего перорального приема.

Существенным отличием заявляемых препаратов и способа их получения является то, что удается усилить антигельминтное действие АБЗ за счет образования водорастворимых межмолекулярных комплексов с полимерами (нековалентные и неионные взаимодействия). Во время растворения этих комплексов их концентрация в 5-10² раз превышает концентрацию свободных молекул АБЗ, которая является «действующей» концентрацией в официнальных формах. И именно это явление объясняет увеличение антигельминтной активности. Этим самым подтверждается новизна заявляемых препаратов, обладающих высоким антигельминтным действием при сокращении дозы АБЗ более чем в 10 раз.

Эффективность противопаразитарного средства на основе АБЗ и способ его применения способа демонстрируется приведенными примерами реализации изобретения.

Пример 1. Получение межмолекулярных комплексов АБЗ и арбиногалактана, гидроксиэтилкрахмала и поливинилпирролидона.

Смеси субстанции АБЗ (АБЗ) (ВФС 42-3085-98) с арабиногалактаном (АГ) (Фибролар С, серия 60062008, ТУ 9363-021-39094141-08), гидроксиэтилкрахмалом (ГЭК) (Hydroxyethyl starch, HES 200/0,5) или поливинилпирролидоном (ПВП) (Povidone K 12 Ph. Eur., USP), взятые в весовых соотношениях 1:5, 1:10 и 1:20, были подвергнуты обработке ударно-истирающими воздействиями в шаровой валковой мельнице ВМ-1 в течение времени 2-8 часов. Затем была определена растворимость АБЗ, для чего 0,6 г навески исследуемого материала растворяли в 10 мл дистиллированной воды при +25°C на орбитальном шейкере (170 об/мин) в течение 24 часов. Концентрация АБЗ в растворе определялась с помощью ВЭЖХ. Полученные данные растворимости приведены в Таблицах 1, 2 и 3.

Во всех случаях имеет место повышение растворимости альбендазола Х_АБЗ до ~137 раз, в зависимости от природы полимера, соотношений АБЗ:полимер в композиции и способа их получения. Так, растворимость/«прочность» комплексов увеличивается в ряду ПВП<ГЭК<АГ, а также при массовых соотношениях 1:5<1:10<1:20. Исходя из положения, что концентрация комплексов АБЗ должна многократно (не менее чем в 5 раз) превышать концентрацию его свободных молекул в растворе, из данных, приведенных в Таблицах 1-3, следует, что минимальная доза механической энергии при получении комплексов должна составлять 10 Дж/г для комплексов АБЗ:АГ, ГЭК и 20 Дж/г для комплексов АБЗ:ПВП (соотношение 1:5 по весу). Последняя величина и была выбрана в качестве достаточного критерия условий механической обработки и использовалась при получении комплексов, подвергавшихся фармакологическим испытаниям.

Пример 2. Изучение антигельминтной активности заявляемых межмолекулярных комплексов на модели Trichinella spiralis. Изучение нематодоцидной активности заявляемых препаратов проводили на лабораторной модели трихинеллеза на белых мышах, экспериментально инвазированных Т. spiralis в возрасте 1,5-2 месяцев в дозе 250 личинок на животное (2, 3, 7). Животных заражали через рот введением суспензии с личинками с помощью шприца с канюлей. На 3-и сутки после заражения мышам подопытных групп (по 5 голов в каждой) вводили перорально однократно 3 комплекса АБЗ (АБЗ:ПВП=1:10, АБЗ:АГ=1:10 и АБЗ:ГЭК=1:10), полученные с применением различных полимеров. Мыши четвертой группы получали базовый препарат - АБЗ. Все препараты применяли в дозе 10 мг/кг. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в соответствующих объемах.

Животных убивали декапитацией на 2-е сутки после введения препаратов. Нематодоцидную активность испытуемых препаратов учитывали по результатам гельминтологического вскрытия кишечника, взятия соскобов слизистой оболочки, переваривания в растворе искусственного желудочного сока и подсчета под бинокулярной лупой. Учитывали обнаруженное при этом количество трихинелл. Учет эффективности препаратов проводили по типу «контрольный тест» с расчетом среднего количества обнаруженных нематод и индекса эффективности (ИЭ). Результаты приведены в табл. 4.

Из данных таблицы видно, что комплексы АБЗ с АГ и ПВП обладали 100%-ной активностью, а межмолекулярный комплекс АБЗ: ГЭК=1: 10 оказал нематоцидный эффект, равный 97,47%. Эффективность базового препарата оказалась значительно ниже, о чем указывает обнаружение в кишечнике у мышей в среднем по 66,6±6,2 экз. трихинелл.

У животных контрольной группы обнаруживали в среднем по 248,4±6,3 трихинелл.

Таким образом, межмолекулярные комплексы АБЗ с АГ и ПВП в дозе 10 мг/кг (в пересчете на альбендазол 1,0 мг/кг) оказали 100%-ю эффективность при экспериментальном трихинеллезе мышей.

Пример 3. Изучение антигельминтной активности заявляемых межмолекулярных комплексов на модели Hymenolepis nana. Испытание на цестодоцидную активность межмолекулярных комплексов АБЗ с полимерами в дозах по 10 мг/кг (по препарату) проводили на белых мышах, экспериментально инвазированных Н. nana. Мышей заражали перорально с помощью шприца, снабженного специальной канюлей, из расчета 200 инвазионных яиц на животное. Для этого собранных от предшествующего заражения цестод Н. nana растирали пестиком в ступке или разрушали в небольшом объеме водопроводной воды посредством неоднократного насасывания в шприц с насаженной на него иглой-канюлей для перорального заражения. На 13-е сутки после заражения в желудок мышей разных групп вводили различные тестируемые препараты однократно в дозе 10 мг/кг в 1% крахмальном геле. Животным контрольной группы вводили крахмальный гель в соответствующих объемах. На 4-е сутки после введения препаратов мышей убивали декапитацией. Активность препаратов учитывали по результатам гельминтологического вскрытия кишечника. Извлеченных при вскрытии цестод подсчитывали. Учет эффективности препаратов проводили по типу «контрольный тест» с расчетом среднего количества обнаруженных цестод и интенсэффективности (ИЭ). Результаты приведены в табл. 5.

Из данных таблицы видно, что 100%-ю эффективность при гименолепидозе мышей проявил межмолекулярный комплекс АБЗ: АГ=1: 10. Препарат активен как против имагинальных, так и неполовозрелых цестод. При вскрытии кишечника мышей, получавших этот препарат, цестод не обнаруживали. После введения межмолекулярного комплекса АБЗ: ПВП=1:10 в кишечнике животных находили нежизнеспособных гименолеписов и единичные экземпляры подвижных цестод (90,64%-я эффективность). Межмолекулярный комплекс АБЗ: ГЭК=1:10 оказался недостаточно эффективным против изученных гельминтов. Активность его против цестод была равной 23,6%. Базовый препарат - АБЗ в испытанной дозе не проявил активности против Н. nana.

В кишечнике животных контрольной группы обнаруживали в среднем по 26,7±3,0 экз./гол. Н. nana, из них 35% составили неполовозрелые цестоды.

Пример 4. Изучение антигельминтной активности заявляемых межмолекулярных комплексов на модели Fasciola hepatica. Испытание на трематодоцидную активность (экспериментальный фасциолез белых крыс /доза заражения 20 адолекскариев Fasciola hepatica. на животное/) межмолекулярных комплексов АБЗ с полимерами проводили в дозах по 10 мг/кг (по препарату). Результаты испытаний показали 95,2%-ю эффективность комплексов АБЗ:АГ=Т:10 и АБЗ:ПВП=1:10, тогда как эффективность базового АБЗ составила 45,5% (в дозе 10 мг/кг), т.е. в 2 раза ниже эффективности заявляемых нами препаратов (см. табл. 6).

Пример 5. Эффективность при нематодозах овец при производственных испытаниях межмолекулярных комплексов АБЗ.

Испытание разработанных нами межмолекулярных комплексов АБЗ проводили в экспериментальном хозяйстве «Курилово» Подольского района Московской области в ноябре-декабре 2013 года на 45 помесных овцах разного возраста, спонтанно инвазированных нематодирусами и другими видами желудочно-кишечных стронгилят. Спонтанно инвазированных овец подбирали в опыт по результатам предварительных копроовоскопических исследований методом флотации и эфир-формалиновым методом. Овец разделили на 5 равноценных групп по 8-9 голов в каждой. Животным первой группы вводили перорально однократно межмолекулярный комплекс состава АБЗ-АГ=1:10 (препарат №1) в дозе 1,0 мг/кг по ДВ. Овцы второй группы получали межмолекулярный комплекс состава АБЗ-ПВП=1:10» (препарат №2). Препараты №1 и №2 были получены с применением различных полимеров и процесса механохимической активации. Овцы третьей и четвертой группы получали базовый препарат - АБЗ (субстанция, на основе которой приготовили стандартные лекарственные формы) в дозах 1 и 10 мг/кг, соответственно. Животные контрольной группы препарат не получали.

Эффективность препаратов учитывали по результатам копроовоскопических исследований методом флотации и эфир-формалиновым методом до и через 18 суток после дегельминтизации. Учет эффективности препаратов проводили по типу «контрольный тест» с расчетом среднего количества обнаруженных яиц нематод. Полученные результаты обработали статистически с использованием компьютерной программы Microsoft Excel и они представлены в табл. 7.

Анализ данных таблицы №7 показал, что базовый препарат - АБЗ в дозе 10 мг/кг проявил 100%-ный эффект против нематодирусов и других желудочно-кишечных стронгилят овец, а в дозе 1,0 мг/кг оказался практически неэффективным. Учитывая то, что предлагаемые нами межмолекулярные комплексы (препараты №1 и №2) испытаны в дозах 1,0 мг/кг по действующему веществу АБЗ, то установлено, что эффективность межмолекулярных комплексов в 9,5 и 8,7 раз выше базового препарата при нематодирозе и в 10 раз выше при других желудочно-кишечных стронгилятозах овец. Животные хорошо переносили препараты, побочного их действия на организм не отмечали.

Таким образом, в производственных опытах на овцах, спонтанно инвазированных нематодами подотряда Strongylata, получена высокая эффективность (в 8,5-10 раз выше таковой базового препарата) предлагаемых нами межмолекулярных комплексов АБЗ.

Пример 6. Исследование острой токсичности заявляемых межмолекулярных комплексов. Параметры острой токсичности препаратов (ЛД50) определяли [13. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л.: Госмедиздат, 1963. - 152 с.] по методу Литчфилда-Вилкоксона / J.T. Litchfield, F.H. Wilcoxon / на белых мышах при введении исследуемых препаратов в желудок животных. Межмолекулярные комплексы АБЗ с АГ и ПВП оказались более чем в 2 раза менее токсичными, чем базовый АБЗ (см. табл. 8).

Таким образом, из испытанных межмолекулярных комплексов, высокую эффективность как против нематод Т. spiralis и цестод Н. nana (100%), так и трематод F.hepatiса (95,2%) показал АБЗ:АГ=1:10, что указывает на его широкий спектр антигельминтного действия. Эффективность этой формы на 80,52% выше против цестод, на 36,8% выше против нематод и на 49,7% выше против трематод по сравнению с базовым препаратом АБЗ, который используется в дозе, в 10 раз превышающей дозу межмолекулярного комплекса. Аналогично, высокую эффективность против всех трех видов гельминтозов проявили межмолекулярные комплексы АБЗ с ПВП и ГЭК (см. табл. 4-7).

Кроме того, благодаря заявляемому техническому решению, достигается многократное снижение действующих доз альбендазола, уменьшается острая токсичность и нежелательные побочные эффекты его применения, используются доступные, дешевые водорастворимые полимеры, способные образовывать межмолекулярные комплексы с молекулами альбендазола в массовых соотношениях альбендазол: полимер 1:5-20, тем самым снижается себестоимость действующих доз препаратов. Для получения заявленного средства используется безотходная, производительная и дешевая механохимическая технология.

С помощью заявленного нами противопаразитарного средства и способа его применения удается достичь его высокой противопаразитарной активности в дозах 1 мг/кг по действующему веществу, что в 8,5-10 раз ниже таковой базового АБЗ. Приведенные примеры реализации изобретения подтверждают заявляемые технические решения.