N-(3,4-ДИХЛОРФЕНИЛ)-2-(АЦЕТИЛОКСИ)-3,5-ДИХЛОРБЕНЗАМИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИГЕЛЬМИНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к органической химии и касается нового биологически активного вещества, а конкретно производного бензамида формулы 1, являющегося N-(3,4-дихлорфенил)-2-ацетокси-3,5-дихлорбензамидом:

,

обладающего антигельминтным действием.

В ряду большого количества схожих структур установлена бактерицидная активность, более достоверная при щелочных значениях рН [Lemaire Н. et al. Synthesis and germicidal activity of halogenated salicylanilides and related compounds // J.Pharm. Sci. 1961. V.50. P.831-837].

Известны салициланилиды, обладающие противогрибковой и бактерицидной активностью [См., например: Pat. 2703332 US. Poly Halosalicylanilides; Pat. 2802029 US. Bromsalicyloyl-chloranilide; Pat. 4310682 US. Halosalicylanilide].

Заявлены салициланилиды для лечения заболеваний, при которых полезно увеличение респирации митохондрий [Заявка 2006116421 РФ, 8 МПК С07С 235/64. Анилиды салициловой кислоты].

Описан класс ароматических производных салициланилидов с различными заместителями, их солей, в том числе с аминами, эффективных в отношении паразита печеночной двуустки [Pat. 3914418 US. Method of controlling liver fluke infection].

Предложены композиции с салициланилидами для борьбы с трематодами и нематодами [Pat. 3989826 US. Method of kiling internal Parasites using salicylanilides].

Известно антигельминтное средство, представляющее собой 3,5-дибромсалициловую кислоту, применявшуюся ранее как полупродукт при производстве антигельминтных средств [Пат. 2242976 РФ, МПК А61К 31/60, А61Р 33/10. Антигельминтное средство].

Известны замещенные салициланилиды, обладающие антигельминтной активностью (Pat. 4025647 US. Salicylanilide derivatives having anthel-mintic activity].

В настоящее время в медицине и ветеринарии широко используют антигельминтный препарат НИКЛОЗАМИД (Германия) [См., например: Pat. 3074848 US; claims priority, application Germany 1960.02.02. 2-Hydroxy-5,2'-dichloro-4'-nitrobenzanilide for combating tapeworms; Pat. 2557615 DE, Int. Cl.2 A61K 31/165, 47/00. Neue Niclosamide Suspensionsfor-mulierungen]. В России препарат того же действующего вещества известен под торговым названием ФЕНАСАЛ (СССР) [Лебедева М.Н., Михайлицын Ф.С., Сергиев В.П. Создание отечественных противопаразитарных препаратов / М.Н.Лебедева и [др.] // Мед. паразитология и паразитарные болезни. 2001. №4. С.13-16; Пат 1166370 РФ. Антигельминтное средство; Пат. 2276983 РФ. Цестодоцидная композиция для животных].

ФЕНАСАЛ (Phenasalum), 5,2'-Дихлор-4'-нитросалициланилид или N-(2-хлор-4-нитрофенил)-3-хлорсалициламид. Синонимы: Иомезан, Иомесан, Jometan, Kontal, Lintex, Niclosamidum, Radeverm, Teniarene, Vermitin и др.

ФЕНАСАЛ - нетоксическое вещество (класс IV), его препараты не обладают эмбриотропным, канцерогенным свойствами. ФЕНАСАЛ обладает противоцестодозной активностью, он является протоплазматическим ядом, полностью денатурирующим структуру клеток гельминтов.

К недостаткам препарата следует отнести трудоемкий синтез промежуточного продукта ФЕНАСАЛА 5-хлор-салициловой кислоты, для получения которой используют газообразный хлор, а полноту реакции контролируют по привесу реакционной массы.

Ранее авторами был синтезирован близкий по принципиальной структуре ФЕНАСАЛУ N-(4-метилфенил)-3,5-дибромсалициламид.

Это соединение под условным названием ВИВАЛИН было испытано на сельскохозяйственных животных - овцы, крупный рогатый скот (КРС) во ВНИИ гельминтологии им. К.И.Скрябина (ВИГИС, Москва) [Михайлицын Ф.С., Трусов С.Н., Севбо Д.П., Кошеваров Н.И., Архипов И.А. Оценка широты противогельминтного действия препарата ВИВАЛИН (ВИГ-08) // Мед. паразитология и паразитар. болезни. 2006. №1. С.57-59].

В результате было установлено, что ВИВАЛИН обладает не только противоцестодозной активностью (при монизиозе овец), сравнимой с препаратом ФЕНАСАЛ, но и противотрематодозной активностью при фасциолезе КРС (эффективность 83,5%), при котором ФЕНАСАЛ не используют. ВИВАЛИН (прототип) является наиболее близким по структуре и активности соединению 1 (С-1), его получают в одну стадию взаимодействием n-толуидина с 3,5-дибромсалициловой кислотой в среде толуола в присутствии треххлористого фосфора.

К его недостаткам относится то, что ВИВАЛИН, так же как и ФЕНАСАЛ, не обладает нематодоцидным действием в отношении нематододирусов овец.

Задачей изобретения является расширение спектра антигельминтного действия, повышение активности и расширение арсенала средств воздействия на живой организм.

Задача реализуется созданием средства с широким спектром антигельминтной активности, включающим в качестве активного вещества N-(3,4-дихлорфенил)-2-ацетокси-3,5-дихлорбензамид. Термин «эффективная доза» относится к количеству средства для лечения или профилактики состояния, которое может лечиться введением композиции на основе данного вещества.

Указанное количество является количеством, достаточным для проявления заметного терапевтического, профилактического или облегчающего эффекта. Конкретное эффективное количество для субъекта будет зависеть от массы тела, природы и тяжести состояния, подлежащего лечению. Для корректного сравнения с базовым препаратом предлагаемое средство задавали в дозе по 100 мг/кг.

Пример 1. Получение N-(3,4-дихлорфенил)-2-ацетокси-3,5-дихлорбензамида. Смешивают 7,0 г N-(3,4-дихлофенил)-2-окси-3,5-дибромбензамида (полученного способом, описанным в [J.Pharm. Sci. 1961. V.50. P.831-837], 20 мл ацетона,10 мл уксусного ангидрида и 5 мл пиридина и образовавшийся раствор оставляют на 1 час при комнатной температуре. К концу выдержки из реакционной массы выделяется обильный осадок, который отфильтровывают, предварительно прибавив к реакционной массе 100 мл воды. После высушивания в течение 12 часов при 65С° получают 7,0 г твердого вещества, которое после кристаллизации из этилацетата имеет т.пл. 170-171°С. Полученный таким образом бензамид (С-1) под названием митранокс, представляющий собой белый с кремоватым оттенком порошок, легко растворимый в диоксане, умеренно в спирте, толуоле, нерастворимый в воде, непосредственно использовался для испытания антигельминтной эффективности (примеры 3, 4).

После кристаллизации указанного образца С-1 из спирта получают аналитический образец - белые с кремоватым оттенком мелкие пластинчатые кристаллы с Т. пл. 172-172,5°С. ТСХ на пластинках «Сорбфил» ПТСХ-П-А-УФ в системе толуол-гексан-этилацетат-кислота уксусная ледяная (4:1:0,5:0,2) хроматографически однороден. ПМР - спектр С-1 полностью соответствует его строению. ИК-спектр в диске KBr соответствует формуле 1, N-H амидная 3320 см-1; ^νCO ацетил 1760 см-1;. ^νCO амидн. 1680 см-1.

Молекулярная масса 377,06. Элементный анализ соответствует брутто-формуле: C15H9C14NO2. Найдено, %: С 47,50; Н 2,3; N 3,79. Вычислено %: С 47,78; Н 2,40; N 3,71.

Пример 2. Токсичность средства испытывали на нелинейных белых мышах с массой тела 18-22 г. Вещество вводили в желудок с помощью специального зонда однократно в виде взвеси с крахмальным клейстером. Для каждого опыта использовали не менее 30 мышей, наблюдение за состоянием животных проводили в течение 2 недель с момента введения вещества.

Токсичность заявляемого соединения сравнима с токсичностью вивалина (класс IV), но ниже, чем у ФЕНАСАЛА.

Пример 3. Оценка противоцестодозной активности С-1 (Митранокса) была проведена на 28 овцах, спонтанно инвазированных мониезиями (Moniezia expansa и М. benedeni). (Табл.1).

По результатам копроовоскопических исследований методом флотации животные, спонтанно инвазированные мониезиями, по принципу аналогов были распределены на 4 равноценные группы, по 7 овец в каждой.

Животным первой группы задавали митранокс в дозе 100 мг/кг, а второй - 50 мг/кг. Третья группа для сравнения, как аналог, получала ФЕНАСАЛ в дозе 100 мг/кг. Все препараты давали с водой однократно перорально с помощью резиновой бутылки с учетом массы животных. Овцы четвертой группы препарат не получали и служили контролем (табл.1).

Эффективность препаратов учитывали по результатам количественных исследований проб фекалий животных всех групп до и через 10 суток после введения препарата овцам.

В результате митранокс в дозе 50 и 100 мг/кг показал соответственно 75,8% и 100%-ную эффективность против мониезий овец.

Пример 4. Оценку нематодоцидной активности митранокса проводили на 36 овцах, спонтанно инвазированных стронгилятами пищеварительного тракта, которых разделили на 3 подопытные и контрольную группы. Животным 1-й и 2-группы задавали митранокс в дозе 100 и 50 мг/кг соответственно. Овцы 3-й группы получали фенасал в дозе 100 мг/кг. Все препараты задавали однократно перорально с водой из бутылки с учетом массы животных. Овцы 4-й группы служили контролем и препарат не получали.

В результате митранокс в дозе 100 и 50 мг/кг показал 100 и 95,4%-ную эффективность, а фенасал против кишечных нематод активности не проявил (табл.2).

Расчет эффективности препаратов проводили по типу «контрольный тест», который показывает процент снижения зараженности леченых животных по сравнению с животными контрольной группы (не леченых). В соответствии с Руководством, одобренным Всемирной Ассоциацией за прогресс ветеринарной паразитологии [Wood J.B., Amaral N.K., Bairden K., et al. // Vet Parasitol. 1995. V.58. №1/2. P.181-213]. В период опыта учитывали также и клиническое состояние животных, которое свидетельствовало об их излечении и отсутствии токсического воздействия. Полученные результаты обработали статистически с использованием компьютерной программы Excel. Ранее аналогичным образом испытывался препарат вивалин - прототип (сравнение с фенасалом).

Результаты испытаний заявляемого средства митранокса при мониезиозе и стронгилятозах кишечного тракта овец свидетельствуют о том, что препарат высокоэффективен в испытанных дозах против мониезий и нематод. Через 10 дней после введения митранокса все животные полностью освободились от мониезий, о чем свидетельствует отсутствие яиц мониезий в фекалиях овец.

При гельминтологическом вскрытии тонкого отдела кишечника трех выборочно убитых овец контрольной группы обнаружили, в среднем, по 2,3 экз. Moniezia expansa и 1,5 экз. М.benedeni. Зараженность овец контрольной группы в течение опыта существенно не изменялась. Количество яиц мониезий в среднем г/фекалий овец в начале опыта составило 260,4±15,1 экз. и в конце опыта -267,8±16,1 экз. (Р>0,05). Базовый препарат ФЕНАСАЛ примененный согласно Инструкции в дозе 100 мг/кг, показал 99,9%-ную эффективность.

Таким образом, результаты оценки антигельминтного действия заявляемого средства митранокса показывают, что препарат не уступает по цестодоцидному действию препарату ФЕНАСАЛ, но и обладает нематодоцидным действием. Митранокс, возможно, найдет применение в медицине и ветеринарной практике.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Coennert, R. Sturfe reconstitution and cestodical effect in the Jomesian series. / R. Coennert // Abhandl. Med. Chem. Forschungsst. Farbenfabriken Bayer. - 1963. - Vol.7. - S.540-567.

5,2^/-Dichloro-2-hydroxy-4^/-nitrobenzanilide, an antyhelmintic. Farb. Bayer A.-G. (by R. Goenert and E. Schraufstaeffer). Fr. M 2628 Cl. A61k, C07c) July 24, 1964, Appl. Ang. 9. 1962, 11 pp.

2. Лебедева М.Н., Михайлицын Ф.С., Сергиев В.П. Создание отечественных противопаразитарных препаратов [Текст] / М.Н.Лебедева и [др.] // Мед. паразитология и паразитар. болезни. - 2001. - №4. - С.13-16.

3. Михайлицын Ф.С., Трусов С.Н., Севбо Д.П., Кошеваров Н.И., Архипов И.А. Оценка широты противогельминтного действия препарата вивалин (ВИГ-08) [Текст] / Ф.С.Михайлицын и [др.] // Мед. паразитология и паразитар. болезни. - 2006. - №1. - С.57-59.

4. Инструкция о мероприятиях по предупреждению и ликвидации заболеваемости животных гельминтозами. - М., 1999. С.15.

5. Wood J.B., Amaral N.K., Bairden K., etal. // Vet. Parasitol. - 1995. V.58, №1/2 - Р.181-213.