×
27.01.2015
216.013.20bf

Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР В ВИДЕ СФЕРОИДОВ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ БИОИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ПЕРЕДНИХ СЛОЕВ ИСКУССТВЕННОЙ РОГОВИЦЫ

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к области медицины, офтальмологии и биотехнологии. Предложен способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий использование кусочков лимба. Изобретение может использоваться для конструирования передних слоев искусственной роговицы с целью компенсации поврежденных тканей роговицы глаза. 1 пр.
Основные результаты: Способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий изолирование кусочков лимба, перенос в чашки Петри в раствор Хенкса с антибиотиками, тщательное отмывание, механическое измельчение с помощью ножниц, ферментативную диссоциацию в 0,25% растворе трипсина, центрифугирование, высевание в пластиковые чашки Петри в плотности 100000 клеток/мл в среду, из расчета на 1000 мл раствора, следующего состава: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров 100 мл, культивирование со сменой среды каждые 2-3 дня, снятие с чашек Петри после второго пассажа клеток с помощью растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, высевание в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты, помещение в лунки 12-луночных культуральных планшетов в полной ростовой среде, культивирование в термостатируемой камере прибора Cell-IQ при температуре 37°C и 5% CO, заселение тканевых матриксов 7-дневными сфероидами из стволовых эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока, снятие клеток с подложки с использованием растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, ресуспендирование, доведение до концентрации 600000 клеток в 200 мкл среды и помещение на тканевые матриксы, помещение в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ и культивирование при температуре 37°C и 5% CO.

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для формирования биоинженерной конструкции передних слоев искусственной роговицы на основе тканевого матрикса и культивированных клеток лимбальной зоны глазного яблока.

Разработки в области создания биоинженерных конструкций искусственной роговицы являются одними из самых перспективных для решения проблемы дефицита донорских роговиц. Материал для создания биоинженерных конструкций тканевых матриц искусственных роговиц должен обладать прозрачностью, биосовместимостью, биоинертностью, адгезивностью, заданной стабильностью к биодеградации, иметь определенную пористость, высокую прочность на разрыв и эластичность.

Помимо выбора каркасной биополимерной конструкции, существует проблема ее заполнения клеточными элементами. Лимбальная зона глазного яблока является источником стволовых/прогениторных эпителиоидных и мезенхимальных клеток роговицы. Однако они, при длительном культивировании в монослое, меняют свой фенотип, теряют функциональные характеристики и становятся неспособными к заселению трехмерного матрикса. В настоящее время клеточные технологии находятся на этапе перехода на 3D культивирование. Технология культивирования 3D сфероидов из клеток лимбальной зоны трупного глаза человека позволяет длительно и полноценно сохранять фенотип и функциональные свойства специализированных клеток роговицы и может быть использована для создания биоинженерной конструкции передних слоев искусственной роговицы на базе тканевого матрикса из спидроина.

Авторам не известны аналоги способов подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы.

Задачей изобретения является способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, созданной на основе тканевого матрикса и функционально дифференцированных клеток.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является возможность использования технологии 3D культивирования стромальных и эпителиоидных клеток лимбальной зоны на основе сфероидных технологий для конструирования передних слоев искусственной роговицы, с целью полной или частичной компенсации поврежденных тканей роговицы.

Технический результат достигается тем, что в способе подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, изолированные кусочки лимба переносятся в чашки Петри диаметром 100 мм в раствор Хенкса (NaCl 80,0 г/л, KCl 4,0 г/л, MgSO4×7H2O 1,0 г/л, MgCl2×6H2O 1,0 г/л, Na2HPO4×7H2O 0,9 г/л, KH2PO4 0,6 г/л, глюкоза 10,0 г/л, CaCl2 1,4 г/л, феноловый красный 2,0 г/л) с антибиотиками (пенициллин 250000 международных единиц и стрептомицин 200,0 мг), тщательно отмываются, механически измельчаются с помощью ножниц, ферментативно диссоциируются в 0,25% растворе трипсина, центрифугируются, высеваются в пластиковые чашки Петри в высокой плотности (100000 клеток/мл) в полную ростовую среду следующего состава: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров 100 мл (из расчета на 1000 мл раствора), культивируются со сменой среды каждые 2-3 дня, после второго пассажа клетки снимаются с чашек Петри с помощью растворов версена (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) и 0,25%-ного трипсина, центрифугируются, высеваются в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты, помещенные в лунки 12-луночных культуральных планшетов в полной ростовой среде, культивируются в термостатируемой камере прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) в стандартных условиях (37°C, 5% CO2), тканевые матриксы заселяются 7-дневными сфероидами, сфероиды снимаются с агарозных планшетов полной ростовой средой, пассивно осаждаются в центрифужных пробирках по 15 мл, ресуспендируются в 200 мкл той же среды, переносятся по 300 единиц на тканевые матриксы, через 30 мин в лунки планшетов с клетками добавляется полная ростовая среда до 1 мл, накрываются планшеты специальной крышкой и помещаются в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) и культивируются в стандартных условиях (37°C, 5% CO2).

Изобретение поясняется следующим примером.

Пример

Первичные культуры эпителиоидных и стромальных клеток получали из тканевых сегментов лимба трупного глаза человека. Изолированные кусочки лимба переносили в 100 мм чашки Петри в раствор Хенкса (NaCl 80,0 г/л, KCl 4,0 г/л, MgSO4×7H2O 1,0 г/л, MgCl2×6H2O 1,0 г/л, Na2HPO4×7H2O 0,9 г/л, KH2PO4 0,6 г/л, глюкоза 10,0 г/л, CaCl2 1,4 г/л, феноловый красный 2,0 г/л) с антибиотиками (пенициллин 250000 международных единиц и стрептомицин 200,0 мг), тщательно отмывали, механически измельчали с помощью ножниц и ферментативно диссоциировали в 0,25% растворе трипсина (ПанЭко, Россия). После фильтрации клетки центрифугировали (8 мин, g=100 см2/с) и высевали в пластиковые чашки Петри в высокой плотности (100000 клеток/мл) в полную ростовую среду (на 1000 мл раствора: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров (HyClone, США) 100 мл). Культивировали в CO2 - инкубаторе при 5% CO2 и 37°C со сменой среды каждые 2-3 дня, после второго пассажа снимали с чашек Петри с помощью растворов версена (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) и 0,25%-ного трипсина, центрифугировали (7 мин, g=100 см2/с) и высевали в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты (MicrotissuesTM, США), помещенные в лунки 12-луночных культуральных планшетов (Corning, США) в полной ростовой среде. Культивировали в термостатируемой камере прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) в стандартных условиях (37°C, 5% CO2).

Для подсчета количества клеток и их жизнеспособности использовали автоматический счетчик клеток Countess (Invitrogen, США).

Для заселения тканевых матриксов использовали 7-дневные сфероиды из стволовых/прогениторных эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока. Сфероиды снимали с агарозных планшетов полной ростовой средой, пассивно осаждали в центрифужных пробирках по 15 мл, ресуспендировали в 200 мкл той же среды, переносили по 300 единиц на тканевые матриксы. Через 30 мин в лунки планшетов с клетками добавляли полную ростовую среду до 1 мл, накрывали планшеты специальной крышкой, помещали в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) и культивировали в стандартных условиях (37°C, 5% CO2).

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет использовать технологию 3D культивирования стволовых/прогениторных эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока на основе сфероидных технологий для конструирования передних слоев искусственной роговицы с целью полной или частичной компенсации поврежденных тканей роговицы.

Способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий изолирование кусочков лимба, перенос в чашки Петри в раствор Хенкса с антибиотиками, тщательное отмывание, механическое измельчение с помощью ножниц, ферментативную диссоциацию в 0,25% растворе трипсина, центрифугирование, высевание в пластиковые чашки Петри в плотности 100000 клеток/мл в среду, из расчета на 1000 мл раствора, следующего состава: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров 100 мл, культивирование со сменой среды каждые 2-3 дня, снятие с чашек Петри после второго пассажа клеток с помощью растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, высевание в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты, помещение в лунки 12-луночных культуральных планшетов в полной ростовой среде, культивирование в термостатируемой камере прибора Cell-IQ при температуре 37°C и 5% CO, заселение тканевых матриксов 7-дневными сфероидами из стволовых эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока, снятие клеток с подложки с использованием растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, ресуспендирование, доведение до концентрации 600000 клеток в 200 мкл среды и помещение на тканевые матриксы, помещение в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ и культивирование при температуре 37°C и 5% CO.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 151-160 из 198.
20.04.2016
№216.015.2afc

Способ диагностики меланомы хориоидеи

Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики меланомы хориоидеи. Сущность способа состоит в том, что у пациента с подозрением на меланому хориоидеи осуществляют забор слезной жидкости из обоих глаз, далее определяют концентрацию в слезной жидкости интерлейкина-8 и при...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002582287
Дата охранного документа: 20.04.2016
10.04.2016
№216.015.2c79

Имплантат для операций по укреплению оболочек глаза

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии. Имплантат для операций по укреплению оболочек глаза выполнен из биосовместимого биостабильного полимера изготовленного путем фотополимеризации олигомеров метакрилового ряда. Имплантат выполнен в виде пластины прямоугольной формы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002579281
Дата охранного документа: 10.04.2016
20.04.2016
№216.015.3619

Инструмент для имплантации интракорнеальной оптической линзы для коррекции пресбиопии

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии. Инструмент состоит из соединенных между собой рукоятки и канюли. Дополнительно снабжен рабочей частью, выполненной из биологически инертного материала и имеющей переднюю и заднюю поверхность. Передняя поверхность имеет выпуклую форму,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002581762
Дата охранного документа: 20.04.2016
20.04.2016
№216.015.371c

Дренаж для хирургического лечения глаукомы

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии. Дренаж для хирургического лечения глаукомы состоит из акрилового гидрогеля. Дренаж выполнен в виде пластины треугольной формы с плавным уменьшением толщины от основания к вершине. При этом толщина у основания составляет от 200 мкм до...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002581823
Дата охранного документа: 20.04.2016
10.05.2016
№216.015.3acf

Способ экстракции катаракты с имплантацией интраокулярной линзы на глазах с тампонадой витреальной полости силиконовым маслом

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для экстракции катаракты с имплантацией интраокулярной линзы на глазах с тампонадой витреальной полости силиконовым маслом, после удаления хрусталика и аспирации хрусталиковых масс переднюю камеру глаза и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002583594
Дата охранного документа: 10.05.2016
10.05.2016
№216.015.3c66

Способ коррекции фиброзно-измененных фильтрационных подушек, возникающих в послеоперационном периоде при хирургии глаукомы

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для коррекции фиброзно-измененных фильтрационных подушек, возникающих в послеоперационном периоде при хирургии глаукомы. В условиях стерильной операционной под местной анестезией выполняют нидлинг, для чего используют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002583592
Дата охранного документа: 10.05.2016
10.05.2016
№216.015.3cb5

Способ хирургического лечения травматического макулярного разрыва

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для хирургического лечения травматического макулярного разрыва. После витрэктомии и удаления ЗГМ в 2,0-2,5 мм к нижне-височной аркаде от края разрыва отделяют кончик ВПМ от сетчатки, затем, захватив пинцетом...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002583605
Дата охранного документа: 10.05.2016
10.05.2016
№216.015.3da1

Способ хирургического лечения макулярного разрыва, осложненного отслойкой сетчатки

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для хирургического лечения макулярного разрыва, осложненного отслойкой сетчатки. После витрэктомии и удаления задней гиалоидной мембраны вводят ПФОС в полость стекловидного тела до экватора, затем в 2,0-2,5 мм...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002583597
Дата охранного документа: 10.05.2016
10.05.2016
№216.015.3db7

Способ доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глазного яблока

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глазного яблока. Производят сквозной прокол оболочек глазного яблока портом 27G на расстоянии 4,0 мм от лимба в направлении к экватору...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002583599
Дата охранного документа: 10.05.2016
20.05.2016
№216.015.3fbb

Способ лечения кератоконуса и миопии высокой степени с тонкой роговицей

Изобретение относится к медицине, а именно в офтальмологии, и предназначено для лечения кератоконуса и миопии высокой степени с тонкой роговицей. Фемтосекундным лазером выполняют интрастромальный тоннель в форме кольца внутренним диаметром 3-5 мм, наружным 7-9 мм на глубине 250-350 мкм. В...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002584087
Дата охранного документа: 20.05.2016
Показаны записи 151-160 из 222.
27.01.2016
№216.014.bd38

Способ установления стадий первичной открытоугольной глаукомы

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и может быть использовано для установления стадии первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ). Измеряют с помощью ультразвуковой биомикроскопии толщину склеры в мм и акустическую плотность склеры в децибелах (дБ) в лимбальной и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002573798
Дата охранного документа: 27.01.2016
10.03.2016
№216.014.be61

Способ хирургического лечения начальной первичной открытоугольной глаукомы

Изобретение относится к медицине, а точнее к офтальмологии, и предназначено для хирургического лечения начальной первичной открытоугольной глаукомы. Выполняют непроникающую глубокую склерэктомию, вскрытие наружной стенки Шлеммова канала. Последовательно вводят в образовавшиеся просветы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576818
Дата охранного документа: 10.03.2016
10.03.2016
№216.014.be6a

Дренаж для хирургического лечения глаукомы

Изобретение относится к медицине, более конкретно к офтальмологии, и представляет собой дренаж для хирургического лечения глаукомы. Дренаж состоит из акрилового гидрогеля. Выполнен в виде пластины со скругленными краями толщиной от 50 мкм до 400 мкм, длиной от 1 до 8 мм и шириной от 0,5 мм до...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576815
Дата охранного документа: 10.03.2016
10.03.2016
№216.014.bee7

Способ прогнозирования перехода витреофовеолярного тракционного синдрома в сквозной макулярный разрыв

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для прогнозирования перехода витреофовеолярного тракционного синдрома в сквозной макулярный разрыв. Для прогнозирования перехода витреофовеолярного тракционного синдрома в сквозной макулярный разрыв приняли коэффициент...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576813
Дата охранного документа: 10.03.2016
10.03.2016
№216.014.bf0f

Способ получения органной культуры собственно сосудистой оболочки из глаза взрослого донора-трупа

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии и трансплантологии, и касается получения органной культуры собственно сосудистой оболочки глаза (ССО). Для этого удаляют из глазного яблока взрослого донора-трупа роговично-склеральный диск. Затем глазное яблоко осматривают на...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576573
Дата охранного документа: 10.03.2016
10.03.2016
№216.014.bf22

Способ лазерного лечения первичной открытоугольной глаукомы после проведенной микроинвазивной непроникающей глубокой склерэктомии

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и касается лазерного лечения первичной открытоугольной оперированной глаукомы. Осуществляют воздействие на пигментные клетки и псевдоэксфолиации трабекулярной сети (ТС) глаза наносекундным Nd-YAG лазерным излучением длиной волны 532...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576811
Дата охранного документа: 10.03.2016
10.03.2016
№216.014.c033

Способ диагностики друз диска зрительного нерва

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для диагностики друз зрительного нерва. Измеряют площадь нейроретинального пояска зрительного нерва (Rim Aria), объема экскавации диска зрительного нерва. Диагностику проводят методом оптической когерентной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576810
Дата охранного документа: 10.03.2016
10.03.2016
№216.014.c124

Способ лазерного лечения гемангиомы хориоидеи

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для лечения гемангиомы хориоидеи (ГХ). Выявляют методом ангиографии с флюоресцеином или ангиографии с индоцианином зеленым фокусы новообразованных сосудов ГХ в хориоидальной и в ранней артериальной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576822
Дата охранного документа: 10.03.2016
27.03.2016
№216.014.c5f7

Способ диагностики состояния роговицы после проведенных на ней операций

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для определения состояния роговицы после проведенных на ней операций. После проведения операций на роговице на сроках наблюдения 2 недели, 1 месяц, 3 месяца проводят диагностику состояния роговицы. Определяют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002578821
Дата охранного документа: 27.03.2016
27.03.2016
№216.014.c674

Способ получения органной культуры хороидально-пигментного комплекса из глаза взрослого донора-трупа

Изобретение относится к медицине. После удаления из глазного яблока взрослого донора-трупа роговично-склерального диска глазное яблоко при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части собственно сосудистой оболочки (ССО) и выхода стекловидного тела за...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002578526
Дата охранного документа: 27.03.2016
+ добавить свой РИД