Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К НАРУШЕНИЯМ СЕРДЕЧНОЙ ПРОВОДИМОСТИ

Изобретение относится к медицине, а именно кардиологии и генетике, и может быть использовано для диагностики генетической предрасположенности к нарушениям сердечной проводимости у человека.

Одной из причин сердечно-сосудистой смертности являются различные нарушения сердечной проводимости (блокады сердца). Генетическая диагностика наследственных нарушений сердечной проводимости, основанная на определении генов-предикторов развития заболевания, может способствовать их раннему выявлению и профилактике. К настоящему времени описано большое количество генетических маркеров различных форм нарушений сердечной проводимости: синдрома удлиненного и укороченного интервала QT, синдрома Вольфа-Паркинсона-Уайта, синдрома Бругада, Лева-Ленегра и др. Большинство из них представляют собой гены, кодирующие белки ионных каналов (калиевых, натриевых) кардиомиоцитов и их модуляторов (Заклязьминская, Е.В. Генетическое разнообразие сердечно-сосудистых заболеваний и возможности молекулярной диагностики / Е.В. Заклязьминская, С.И. Козлова, А.В. Поляков // Вестник Аритмологии. - 2005. - №37. - С.69-76). Однако недостаточно изучено влияние генов коннексина 40 (Cx40), сердечных натриевых каналов (SCN5A), α-2β-адренорецептора (ADRα2β), эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3) на развитие первичных нарушений сердечной проводимости. На животной модели было доказано, что коннексин 40 необходим для быстрого проведения импульса в системе Гиса-Пуркинье (Simon, A.M. Mice lacking connexin40 have cardiac conduction abnormalities characteristic of atrioventricular block and bundle branch block / A.M. Simon, D.A. Goodenough. D.L. Paul // Curr. Biol. - 1998. - Vol.5, №8. - P.295-298). N. Makita и соавторы доказали участие гена Cx40 в нормальном функционировании проводящей системы сердца. Они обследовали 156 пробандов с прогрессивной семейной блокадой сердца I типа и выявили мутацию Cx40-Q58L, которая ухудшает образование щелевых контактов и межклеточное взаимодействие кардиомиоцитов (A connexin40 mutation associated with a malignant variant of progressive familial heart block type I/N. Makita, A. Seki, N. Sumitomo et al. // Circ. Arrhythm. Electrophysiol. - 2012. - V.5, №1. - P.163-172). Анализ гаплотипов больных с идиопатической фибрилляцией предсердий показал статистически значимое преобладание генотипа Cx40 (-44A, +71G) по сравнению с контрольной группой (The association of human connexin 40 genetic polymorphisms with atrial fibrillation / J.M. Juang, Y.R. Chern, C.T. Tsai et al. // Int. J. Cardiol. - 2007. - V.116, №1. - P.107-112). Замена G на A в гене SCN5A была выявлена у 2 детей, страдающих AB-блокадой. Указанная мутация приводила к замене серина на глицин (G298S) в домене I петли S5-S6 и аспарагина на аспарагиновую кислоту (D1595N) в сегменте S3 домена IV (Wang, D.W. Clinical, genetic, and biophysical characterization of SCN5A mutations associated with atrioventricular conduction block / D.W. Wang, P.C. Viswanathan, J.R. Balser // Circulation. - 2002. - V.105, №3. - P.341-346). Описаны четверо детей из немецкой семьи с анамнезом ранних нарушений сердечного ритма и проводимости, охватывающих синдром слабости синусового узла, тяжелые желудочковые тахикардии, все четверо детей являлись гомозиготными носителями миссенс-мутации SCN5A (p.I230T) (A homozygous SCN5A mutation in a severe, recessive type of cardiac conduction disease / A. Neu, M. Eiselt, M. Paul et al. // Hum. Mutat. - 2010. - 1609-1621). Определена роль мутации гена SCN5A в развитии синдрома слабости синусового узла. Мутация наследуется аутосомно-рецессивно и обусловливает образование нефункционирующих натриевых каналов в клетках синоатриального узла (Congenital sick sinus syndrome caused by recessive mutations in the cardiac sodium channel gene (SCN5A) / D.W. Benson, D.W. Wang, M. Dyment et al. // J. Clin. Invest. - 2003. - Vol.7, №112. - P.1019-1028). Экспериментально доказано, что носители генотипов DD и ID гена ADRα2β в большей степени подвержены риску внезапной сердечной смерти (ВСС), чем носители II генотипа полиморфизма I/D (Variation in the alpha2B-adrenoceptor gene as a risk factor for prehospital fatal myocardial infarction and sudden cardiac death / A. Snapir, J. Mikkelsson, M. Perola et al. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2003. - V.41, №2. - P.190-194). Кроме того, известно, что мужчины-носители варианта DD гена ADRα2β в 2,2 раза чаще подвержены острому коронарному синдрому, чем носители других вариантов (An insertion/deletion polymorphism in the alpha2B-adrenergic receptor gene is a novel genetic risk factor for acute coronary events / A. Snapir, P. Heinonen, T.P. Tuomainen et al. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2001. - V.37, №6. - P.1516-1522). При изучении влияния полиморфизмов NOS3 Т(-786)С и экзон 7 G(894)T на сердечно-сосудистую смертность было установлено значительное влияние T(-786)C) генотипа на выживаемость. Индивиды с генотипом TT, выживаемость которых была ниже, имели более высокий уровень миелопероксидазы в плазме крови и низкий уровень нитротирозина по сравнению с пациентами генотипа СС (The T(-786)C endothelial nitric oxide synthase genotype predicts cardiovascular mortality in high-risk patients / G.P. Rossi, G. Maiolino, M. Zanchetta et al. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2006. - V.48, №6. - P.1166-1174). Полиморфизм VNTR гена NOS3 ассоциируется с увеличенными эхокардиографическими значениями гипертрофии левого желудочка у больных эссенциальной гипертонией (Косянкова, Т.В. Взаимосвязь гена эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3) с сердечно-сосудистыми заболеваниями / Т.В. Косянкова, К.В. Пузырев, С.В. Буйкин, А.Г. Матафонов // Науки о человеке: сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородова, Л.В. Капилевич. - Томск, СГМУ. - 2002. - 254 с.).

Однако представленные результаты исследований включают анализ однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) или мутаций одного или двух генов и рассматривают их роль в развитии лишь некоторых патологий сердечно-сосудистой системы. В частности, отсутствуют данные о роли ОНП -44A/G гена Cx40, A/G гена SCN5A, VNTR4a/4b гена NOS3, I/D гена ADRα2β в развитии таких нарушений сердечной проводимости как синдром слабости синусового узла (СССУ), атриовентрикулярные блокады (АВБ), полная блокада правой ножки пучка Гиса (ПБПНПГ), блокада левой ножки пучка Гиса (БЛНПГ) у человека. Кроме того, большинство исследований проводилось на европейском и азиатском населении, справедливость полученных данных в отношении сибирской популяции не изучалась.

Наиболее близким к предлагаемому является способ генетической диагностики подверженности к сердечно-сосудистым заболеваниям (патент РФ №2376372, C12N 15/00. Бюл.№35, 20.12.2009 г.). Способ основан на определении генотипов по полиморфным вариантам (однонуклеотидным полиморфизмам) гена рецептора 1 типа ангиотензина II, гена ангиотензин-превращающего фермента, гена метилентетрагидрофолат-редуктазы, гена ангиотензиногена, гена G-протеина бета 3, гена эндотелиальной синтазы оксида азота, гена фактора свертываемости F5, гена интегрина B3, гена фактора свертываемости F2 и оценке риска путем суммирования количества баллов, присвоенных каждому генотипу. При этом генотипам «низкого» риска сердечно-сосудистой патологии присваивается 0 баллов, генотипам «среднего» риска присваивается 0,5 баллов, генотипам «высокого» риска присваивается 1 балл. Риск сердечно-сосудистых болезней считается «низким» при сумме баллов от 0 до 3, средним - от 3,5 до 6, высоким - от 6,5 до 11 баллов.

Задача предлагаемого способа: выделить генетические маркеры, которые позволят повысить качество диагностики наследственной предрасположенности к нарушениям сердечной проводимости: синдрому слабости синусового узла (СССУ), атриовентрикулярной блокаде (АВБ), полной блокаде правой ножки пучка Гиса (ПБПНПГ), блокаде левой ножки пучка Гиса (БЛНПГ).

Поставленную задачу решают за счет того, что выявляют генотип пациента, ген и полиморфизм для каждого из нарушений сердечной проводимости: синдрома слабости синусового узла, атриовентрикулярной блокады, полной блокады правой ножки пучка Гиса, блокады левой ножки пучка Гиса; для анализа используют 4 полиморфизма 4 генов: помимо анализа полиморфизма VNTR4a/4b гена NOS3 осуществляют анализ полиморфизмов -44A/G гена Cx40, A/G гена SCN5A и I/D гена ADRα2β; генотипам низкого риска нарушений сердечной проводимости присваивают 0%, к ним относят генотипы -44GG гена Cx40, AA гена SCN5A, 4a/4a гена NOS3 и II гена ADRα2β, генотипам среднего риска присваивают 50%, к ним относят генотипы -44AG гена Cx40, AG гена SCN5A, 4a/4b гена NOS3 и ID гена ADRα2β, генотипам высокого риска присваивают 100%, к ним относят генотипы -44AA гена Cx40, GG гена SCN5A, 4b/4b гена NOS3 и DD гена ADRα2β; риск развития нарушений сердечной проводимости рассчитывают по формуле: (a+b+c+d)/n, где: a - количество процентов, соответствующее генотипу человека по гену Cx40, b - количество процентов, соответствующее генотипу человека по гену SCN5A, c - количество процентов, соответствующее генотипу человека по гену NOS3, d - количество процентов, соответствующее генотипу человека по гену ADRα2β, n - количество анализируемых генов у человека; генетический риск считают низким при значении от 0% до 30%, средним - от 30% до 60%, высоким - более 60%.

Способ осуществляют следующим образом.

У человека забирают кровь из периферической вены в объеме 3 мл, проводят анализ любым из известных молекулярно-генетических методов однонуклеотидных полиморфизмов -44A/G гена Cx40, A/G гена SCN5A, VNTR4a/4b гена NOS3 и I/D гена ADRα2β. Каждому возможному генотипу, в зависимости от того, является ли он протективным или предрасполагающим к развитию патологии, присваивают определенное количество процентов в соответствии с данными, приведенными в табл.1. Эти данные были получены при анализе групп больных с различными нарушениями сердечной проводимости г. Красноярска и здоровых жителей г. Новосибирска (всего проанализировано 359 случаев). Генотипам низкого риска нарушений сердечной проводимости присваивают 0%, к ним относятся генотипы -44GG гена Cx40, AA гена SCN5A, 4a/4a гена NOS3 и II гена ADRα2β. Генотипам среднего риска присваивают 50%, к ним относятся генотипы -44AG гена Cx40, AG гена SCN5A, 4a/4b гена NOS3 и ID гена ADRα2β. Генотипам высокого риска присваивают 100%, к ним относятся генотипы -44AA гена Cx40, GG гена SCN5A, 4b/4b гена NOS3 и DD гена ADRα2β.

Для оценки генетического риска развития заболевания (СССУ, и/или АВБ, и/или НБПНПГ, и/или БЛНПГ) необходим анализ не менее двух генов из четырех указанных в табл.1. В зависимости от выявленного генотипа у человека каждому исследуемому гену присваивают процент вероятности развития заболевания (согласно таблице 1). Затем полученные значения суммируют и делят на общее число генов, анализируемых у человека, т.е. определяют среднее значение генетического риска развития заболевания на основании имеющихся генотипов исследуемых генов у человека. Формула расчета риска развития заболевания: (a+b+c+d)/n, где: а - количество процентов, соответствующее генотипу человека по гену Cx40, b - количество процентов, соответствующее генотипу человека по гену SCN5A, c - количество процентов, соответствующее генотипу человека по гену NOS3, d - количество процентов, соответствующее генотипу человека по гену ADRα2β, n - количество анализируемых генов у человека.

Выделение генетических маркеров, которые позволят улучшить диагностику наследственной предрасположенности к нарушениям сердечной проводимости, проводили на группах набранных индивидуумов с идиопатическими формами нарушений сердечной проводимости: синдромом слабости синусового узла (СССУ) - 98 человек, атриовентрикулярной блокадой (АВБ) - 73 человека, полной блокадой правой ножки пучка Гиса (ПБПНПГ) - 86 человек, блокадой левой ножки пучка Гиса (БЛНПГ) - 102 человека (из них 19 человек с полной блокадой левой ножки пучка Гиса и 83 человека с блокадой только передней ветви левой ножки пучка Гиса). Пациенты были набраны в ходе исследования, проводившегося сотрудниками кафедры внутренних болезней №1 Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого и повторно обследованы спустя 10 лет. Всем обследуемым после подписания информирования согласия было проведено стандартное кардиологическое обследование на базе МБУЗ ГКБ №20 им. И.С. Берзона г. Красноярска (сбор жалоб, анамнеза, клинический осмотр, электрокардиографию, атропиновый тест, эхокардиоскопию, велоэргометрию, чреспищеводную стимуляцию предсердий, суточное мониторирование ЭКГ по Холтеру) для верификации диагноза. Кроме того, всем обследуемым проведено молекулярно-генетическое исследование в ГУ НИИ терапии СО РАМН г.Новосибирска: определялись однонуклеотидные полиморфизмы -44AJG гена Сx40, A/G гена SCN5A, VNTR4a/4b гена NOS3 и I/D гена ADRα2β.

По однонуклеотидному полиморфизму (ОНП) -44A/G гена Cx40 прогенотипированы 67 больных с СССУ, 53 человека с АВБ, 86 человек с ПБПНПГ и 98 человек с БЛНПГ (табл.2).

Как видно из табл.2, среди больных с идиопатическим СССУ преобладает гомозиготный генотип по редкому аллелю -44AA гена Cx40 (24 человека - 35,8%) по сравнению с гомозиготным генотипом по распространенному аллелю -44GG гена Cx40 (15 человек - 22,4%). Полученные результаты подтверждают, что генотип -44AA гена Cx40 является прогностически неблагоприятным фактором развития идиопатического СССУ (табл.1). В то же время среди больных с АВБ, ПБПНПГ, БЛПГ аналогичной закономерности не наблюдается. Это объясняется тем, что однонуклеотидный полиморфизм -44A/G гена Cx40 не участвует в развитии указанных заболеваний (табл.1).

По однонуклеотидному полиморфизму A/G гена SCN5A прогенотипированы 98 больных с СССУ, 73 больных с АВБ, 87 больных с ПБПНПГ, 102 больных с БЛНПГ (табл.3).

Как видно из табл.3, среди больных с идиопатическими нарушениями сердечной проводимости (СССУ, АВБ, ПБПНПГ, БЛНПГ), преобладает гомозиготный генотип по редкому аллелю GG гена SCN5A (80 человек - 81,6% с СССУ, 57 человек - 78,1% с АВБ, 65 человек - 74,7% с ПБПНПГ, 78 человек - 76,5% с БЛНПГ) по сравнению с гомозиготным генотипом по распространенному аллелю AA гена SCN5A (2 человека - 2,0% с СССУ, 5 человек - 6,8% с АВБ, 3 человека - 3,4% с ПБПНПГ, 9 человек - 8,8% с БЛНПГ). Полученные результаты подтверждают, что генотип GG гена SCN5A является прогностически неблагоприятным фактором развития указанных заболеваний (табл.1).

По однонуклеотидному полиморфизму VNTR 4a/4a гена NOS3 прогенотипированы 90 больных с СССУ, 69 больных с АВБ, 83 больных с ПБПНПГ, 101 больной с БЛНПГ (табл.4).

Как видно из табл.4, среди больных с идиопатическими нарушениями сердечной проводимости (СССУ, АВБ, ПБПНПГ, БЛНПГ), преобладает гомозиготный генотип 4a/4a гена NOS3 (35 человек - 38,9% с СССУ, 33 человека - 47,8% с АВБ, 42 человека - 50,6% с ПБПНПГ, 51 человек - 50,5% с БЛНПГ) по сравнению с генотипом 4b/4b гена NOS3 (28 человек - 31,1% с СССУ, 18 человек - 26,1% с АВБ, 19 человек - 22,9% с ПБПНПГ, 19 человек - 18,8% с БЛНПГ). Полученный результат можно объяснить тем, что аллель 4a является распространенным аллелем и преобладает в общей популяции людей, a аллель 4b - редкий аллель, частота встречаемости его значительно ниже.

По полиморфизму I/D гена ADRα2β прогенотипированы 92 больных с СССУ, 71 больной с АВБ, 86 больных с ПБПНПГ, 102 больных с БЛНПГ (табл.5).

Как видно из табл.5, среди больных с идиопатической АВБ и ПБПНПГ преобладает гомозиготный генотип по редкому аллелю DD гена ADRα2β (31 человек - 43,7% с АВБ, 31 человек - 36,0% с ПБПНПГ) по сравнению с гомозиготным генотипом по распространенному аллелю II гена ADRα2β (23 человека - 32,4% с АВБ, 18 человек -20,9% с ПБПНПГ). Полученные результаты подтверждают, что генотип DD гена ADRα2β - является прогностически неблагоприятным фактором развития идиопатической АВБ и ПБПНПГ (табл.1). В то же время среди больных с наследственными СССУ и БЛНПГ аналогичной закономерности не наблюдается. Это объясняется тем, что полиморфизм I/D гена ADRα2β не участвует в развитии указанных заболеваний (табл.1).

Пример 1: молекулярно-генетическое исследование пациента С., 36 лет.

Проведен забор крови из вены в количестве 3 мл. Проанализированы следующие полиморфные аллельные варианты генов для установления генетической предрасположенности к идиопатической полной блокаде правой ножки пучка Гиса:

- Ген сердечных натриевых каналов (SCN5A) - A/G

- Ген эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3) - VNTR4a/4b

- Ген альфа-2бета-адренорецептора (ADRα2β) - I/D

Результаты генетического тестирования пациента С.

- Ген SCN5A, полиморфизм A/G, генотип пациента AA - 0%

- Ген NOS3, полиморфизм VNTR4a/4b, генотип пациента 4a/4a - 0%

- Ген ADRα2β, полиморфизм I/D, генотип пациента ID - 50%

Расчет генетического риска: (0%+0%+50%)/3=16,7% - низкий риск.

Рекомендации для пациента С.

- Диспансерная группа Д-I

- Консультация врача-терапевта 1 раз в год

- Электрокардиограмма - 1 раз в 3 года, после 40 лет - 1 раз в год

- Рекомендации по здоровому образу жизни

Пример 2: молекулярно-генетическое исследование пациента Н., 21 год.

Проведен забор крови из вены в количестве 3 мл. Проанализированы следующие полиморфные аллельные варианты генов для установления генетической предрасположенности к идиопатической атриовентрикулярной блокаде:

- Ген сердечных натриевых каналов (SCN5A) - A/G

- Ген эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3) - VNTR4a/4b

- Ген альфа-2бета-адренорецептора (ADRα2β) - I/D

Результаты генетического тестирования пациента Н.

- Ген SCN5A, полиморфизм A/G, генотип пациента AG - 50%

- Ген NOS3, полиморфизм VNTR4a/4b, генотип пациента 4a/4b - 50%

- Ген ADRα2β, полиморфизм I/D, генотип пациента ID - 50%

Расчет генетического риска: (50%+50%+50%)/3=50% - средний риск.

Рекомендации для пациента Н.

- Диспансерная группа Д-II

- Консультация врача-кардиолога 1 раз в год с обязательным проведением электрокардиограммы

- Атропиновый тест и мониторирование ЭКГ по Холтеру - 1 раз в 3 года

- Исключение лекарственных препаратов, ухудшающих сердечную проводимость (β-адреноблокаторы, антагонисты кальция группы верапамила и дилтиазема, ингибиторы If каналов)

- Рекомендации по здоровому образу жизни

Пример 3: молекулярно-генетическое исследование пациента М., 42 года.

Проведен забор крови из вены в количестве 3 мл. Проанализированы следующие полиморфные аллельные варианты генов для установления генетической предрасположенности к идиопатическому синдрому слабости синусового узла:

- Ген коннексин 40 (Cx40) - -44A/G

- Ген сердечных натриевых каналов (SCN5A) - A/G

- Ген эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3) - VNTR4a/4b

Результаты генетического тестирования пациента М.

- Ген Cx40, полиморфизм -44A/G, генотип пациента 44AA - 100%

- Ген SCN5A, полиморфизм A/G, генотип пациента GG - 100%

- Ген NOS3, полиморфизм VNTR4a/4b, генотип пациента 4a/4b - 50%

Расчет генетического риска: (100%+100%+50%)/3=83,3% - высокий риск

Рекомендации для пациента М.

- Диспансерная группа Д-II

- Консультация врача-кардиолога 2 раза в год с обязательным проведением электрокардиограммы

- Атропиновый тест и мониторирование ЭКГ по Холтеру - 1 раз в год

- Биохимический анализ крови: электролитный состав - 1 раз в год

- Исключение лекарственных препаратов, ухудшающих сердечную проводимость (β-адреноблокаторы, антагонисты кальция группы верапамила и дилтиазема, ингибиторы If каналов)

- Рекомендации по здоровому образу жизни

Предлагаемый способ позволяет выделить генетические маркеры развития каждого из первичных нарушений сердечной проводимости: синдрома слабости синусового узла, атриовентрикулярной блокады, полной блокады правой ножки пучка Гиса, блокады левой ножки пучка Гиса у человека и повысить качество диагностики наследственной предрасположенности к указанным патологиям, что позволит проводить раннюю профилактику и осуществлять персонализированный подход к лечению данных заболеваний.