Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS MUSCULUS L. CCHFV Vd-2-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА 1E2/E5 К ВИРУСУ КРЫМ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ

Изобретение относится к биотехнологии получения гибридом-продуцентов моноклональных антител (МКА) заданной специфичности и может быть использовано в вирусологических и иммунологических исследованиях при создании тест-системы иммуноферментной, предназначенной для обнаружения антигенов вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) - возбудителя опасного трансмиссивного природно-очагового заболевания человека, входящего в перечень инфекционных (паразитарных) болезней, требующих проведения мероприятий по санитарной охране территории Российской Федерации [1, 2]. Штамм-продуцент моноклональных антител к вирусу ККГЛ назван CCHFV Vd-2 (1E₂/E₅). Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-ОБОЛЕНСК» под номером H-26.

При выполнении работ по обнаружению возбудителя в пробах клинического и полевого материала руководствуются принципами организации исследований материала, подозрительного на зараженность вирусом ККГЛ, в учреждениях Роспотребнадзора, изложенных в «Практических руководствах» [3, 4], а также в МУК 4.2.3007-12 [5]. Согласно этим документам, одним из регламентированных иммунодиагностических методов обнаружения вируса ККГЛ является сэндвич-вариант иммуноферментного анализа (ИФА).

В настоящее время для иммуноферментного выявления антигенов вируса ККГЛ осуществляется выпуск «Тест-системы иммуноферментной для выявления вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки «Векто Крым-КГЛ-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия; Регистрационный номер РК-ИМН-5№007764, дата регистрации 14.12.2010), изготавливаемой на основе поликлональных антител к вирусу ККГЛ.

Известно, что применение МКА в качестве основы средств обнаружения возбудителей опасных инфекционных заболеваний, в том числе и вируса ККГЛ, открывает новые перспективы для создания высокоэффективных стандартизированных препаратов для методов экспресс-обнаружения и идентификации искомых патогенов. При создании тест-систем иммуноферментных для выявления того или иного возбудителя, компоненты которых предназначены для выполнения сэндвич-варианта твердофазного ИФА, используют, как правило, два варианта МКА различной эпитопной направленности, одно из которых выполняет функции «захвата» антигена, а второе - функции детекции образовавшегося иммунного комплекса. Во избежание ошибок в оценке результатов реакции подбор наиболее эффективных пар моноклональных ингредиентов проводят из числа вариантов, входящих в панель МКА, узнающих эпитопы на диагностически значимых антигенных мишенях конкретного возбудителя.

О возможностях применения МКА к вирусу ККГЛ сообщали отечественные и зарубежные авторы [6, 7, 8, 9, 10, 11, 12].

Ими были получены экспериментальные образцы препаратов для применения в иммуноферментном и иммунофлуоресцентном методах детекции вируса ККГЛ, апробированные в лабораторных условиях, подтверждены основные преимущества работы с МКА: возможность работы с гомогенным по составу сырьем для изготовления высокоактивных иммунодиагностических реагентов заданной специфичности. Данные о внедрении этих диагностических средств в практическое здравоохранение отсутствуют. В настоящее время существует только один зарегистрированный в качестве медицинского изделия набор, предназначенный для выявления вируса ККГЛ в биологических жидких пробах (набор для иммуноферментного анализа производства ЗАО «Вектор Бест», Новосибирск, кат.№D-5056, «ВектоКрым-КГЛ-антиген», РУ №ФСР 2010/07327). Ввиду отсутствия стандартных препаратов для контроля качества лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) неизвестна относительная чувствительность и специфичность этого набора.

Цель изобретения - получение штамма гибридомы-продуцента высокоспецифичного, моноклонального антитела - компонента для изготовления тест-системы иммуноферментной, предназначенной для обнаружения антигенов вируса ККГЛ в пробах биологического материала.

Получение гибридомы достигается гибридизацией двух типов клеток: спленоцитов инбредной мыши линии BALB/c, иммунизированной антигеном вируса ККГЛ, и клеток мышиной миеломы.

Гибридома-продуцент МКА 1E₂/E₅ получена слиянием спленоцитов иммунной мыши линии BALB/c с клетками мышиной миеломы Sp 2/0 в присутствии конъюгирующего агента - полиэтиленгликоля (ПЭГ-4000), последующего рассева взвеси клеток в лунки 96-луночных культуральных пластин, выращивания в селективной среде, отбора первичного клона, его клонирования и реклонирования методом лимитирующих разведений. Полученный штамм, названный CCHFV Vd-2 (1E₂/E₅), характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Для культивирования гибридомы in vitro используют среду RPMI-1640 с 15% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 mM L-глютамина, 10 mM Hepes, 4 mM пирувата натрия.

Клетки культивируют при 37°C в атмосфере 5-7% CO₂ и влажности 70-80%. Пересевы делают каждые 3-4 сут, интенсивность роста популяции клеток контролируют при просмотре лунок пластин в инвертированном микроскопе. Кратность рассева 1:4-1:8. Характер роста культуры полусуспензионный.

Культивирование в организме сингенного животного. Для накопления асцита in vivo клетки гибридомы вводят внутрибрюшинно предварительно праймированным мышам линии BALB/c, по 2·10⁶-4·10⁶ клеток на мышь. Асцит образуется через 2-4 недели.

Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 0,53 мкг/мл, в асцитической жидкости - 8-10 мг/мл. Объем асцитической жидкости в среднем равен 3-4 мл.

Характеристика получаемого продукта. Антитела относятся к классу IgG₁. Они специфически взаимодействуют с антигеном вируса ККГЛ. Специфичность взаимодействия определяют с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ТИФМ).

Криоконсервирование. Вне периода экспериментов по накоплению препаративных количеств МКА 1E₂/E₅ клетки гибридомы сохраняют в криоконсервированном состоянии. Для перевода их в такое состояние взвесь клеток гибридомы в количестве 4·10⁶ клеток в 1 мл защитной среды, состоящей из среды RPMI-1640 с 20% ЭТС и 7% диметилсульфоксида, переносят в пластиковые ампулы. Ампулы помещают в аппарат для криоконсервирования биологического материала. Используют режим постепенного программируемого понижения температуры: в течение 20 минут - снижение температуры образца до 0°C, далее со скоростью 1°C в минуту до температуры минус 40°C и со скоростью 5°C в минуту от минус 40°C до минус 70°C. Затем ампулы погружают в биохранилище с жидким азотом и хранят до момента использования. Размораживание производят при 37°C на водяной бане в течение 2-3 минут. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 80% и более.

Пример 1. Получение штамма гибридомы-продуцента. Мышь линии BALB/c иммунизируют инактивированным антигеном вируса ККГЛ. Для стимуляции В-лимфоцитов мыши используют схему дробного введения минимальных доз антигена в течение относительно короткого периода времени (5 недель). Первую инъекцию (0 день) выполняют подкожно в область спины смесью антигена (15 мкг антигена в 0,3 мл физиологического раствора (ФР) с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда). Вторую, третью и четвертую инъекции (7, 14 и 21 день) - внутрибрюшинно по 15 мкг антигена в 0,3 мл ФР, пятую бустирующую инъекцию - через 2 недели внутриселезеночно (20 мкг). Суммарная доза антигена не должна превышать 80 мкг белка по Бредфорду. Через 3 суток после этого выполняют гибридизацию 1·10⁸ спленоцитов иммунной мыши с 1·10⁷ клеток мышиной миеломы в присутствии 1 мл 50% ПЭГ-4000 в течение 2 минут при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Затем к этой смеси при постоянном перемешивании последовательно добавляют 1, 2, 4, 8 мл бессывороточной среды, каждую порцию в течение 2 минут. После этого клетки центрифугируют при 800-1000 об/мин в течение 10 минут. Осадок ресуспендируют в селективной HAT-среде с 15% ЭТС, 2 mM L-глютамина, 10 mM Hepes, 4 mM пирувата натрия. Клетки высевают в 96-луночную пластину с фидером, по 2,5·10⁵-5·10⁵ клеток в лунку. Смену среды производят каждые 3-4 дня. Скрининг антителопродуцирующих гибридных клонов выполняют не ранее 7-10 суток после рассева в 96-луночные пластины. При просмотре лунок регистрируют те из них, в которых имеет место характерный рост групп клеток, затем из них отбирают не более 50 мкл культуральной среды для исследования в непрямом варианте ТИФМ. Положительные результаты этого метода скрининга, полученные с пробой из одной и той же лунки не менее трех раз, являются основанием для отбора первичного клона-продуцента целевого продукта. Все первичные клоны, отобранные в течение месяца, клонируют и реклонируют методом лимитирующих разведений, производя высевы в лунки предварительно подготовленной 96-луночной пластины с фидером - перитонеальными макрофагами сингенной интактной мыши (по 4-6·10⁴ клеток в каждой лунке). На этом этапе используют среду RPMI-1640 с 15% ЭТС и необходимыми добавками. После второго клонирования каждого из первичных вариантов клонов формируют рабочую коллекцию гибридом-продуцентов МКА заданной специфичности. Среди продуктивных клонов, секретирующих моноклональные иммуноглобулины против антигена вируса ККГЛ, селекционирован клон-продуцент CCHFV Vd-2 (1E₂/E₅).

Пример 2. Накопление МКА. Ампулу с клетками гибридомы достают из биохранилища с жидким азотом и быстро размораживают на водяной бане при 37°C. Для отмывания восстановленной суспензии клеток от примесей защитной среды ее переносят в центрифужную пробирку с 10 мл бессывороточной среды RPMI-1640 и осторожно наслаивают на поверхность жидкости. Клетки осаждают центрифугированием при 800-1000 об/мин, удаляют надосадок, а осевшие клетки вновь суспендируют в полной среде для культивирования гибридомы (RPMI-1640 с 15% ЭТС и необходимыми добавками). Клетки высевают в 5-6 лунок 12-луночной пластины или в матрас с площадью 25 см². При увеличении колонии до размеров, покрывающих половину площади и более производят рассевы на большие площади при обязательном контроле антителопродукции. Условия культивирования in vitro, тактика отбора и замены среды культивирования, рассева размножающейся популяции клеток выполняют так, как описано выше (пример 1). При корректном выполнении этих условий продукция МКА восстанавливается до уровня 0,52-0,54 мкг/мл. Все образцы культуральной среды, отбираемой в моменты ее замены равными объемами свежей среды, собирают во флакон для последующего выделения из нее моноклональных иммуноглобулинов.

Тиражирование клеток гибридомы in vivo в брюшной полости сингенного животного - наиболее эффективный способ накопления высоких концентраций МКА. Животным предварительно внутрибрюшинно вводят по 0,4 мл стерильного минерального масла, пристана - 2,6,10,14-тетраметил-пентадекана или неполного адъюванта Фрейнда. Через 5-7 суток мышам внутрибрюшинно вводят по 2·10⁶-4·10⁶ клеток гибридомы. После накопления асцитической жидкости ее собирают. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость отделяют и используют для выделения антител методом сульфатного трехкратного переосаждения белка при 50% насыщении сульфата аммония. Рыхлый осадок центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 минут, надосадочную жидкость удаляют. Осадок растворяют в 0,01 М фосфатном буфере, диализуют до полного удаления ионов сульфата аммония. Полученный раствор моноклональных иммуноглобулинов стерилизуют методом мембранной фильтрации, ампулируют и хранят при минус 20°C до момента использования. Концентрацию белка в растворе МКА определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Специфическую активность МКА определяют с помощью ТИФМ. За сутки до постановки реакции в лунки полистироловой пластины для иммуноферментного анализа вносят по 100 мкл раствора антигена (с концентрацией 7-10 мкг/мл по белку) в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, pH 9,5. Пластину в течение ночи выдерживают при 4-8°C, затем трижды отмывают забуференным физраствором с 0,05% твина-20 (ЗФР-Т) и выполняют этап блокирования свободных участков пластика 1% раствором бычьего сывороточного альбумина, внося в каждую лунку по 100 мкл этого раствора. Пластину инкубируют при 37°C в термостате в течение 30 минут и вновь трижды отмывают ЗФР-Т. Следующий этап - внесение в лунки пластины по 100 мкл различных разведений МКА, приготовленных на 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4, с 0,05% твина-20 (ФБС-Т). Время инкубации - 1 ч при 37°C, трехкратное отмывание и внесение антивидового конъюгата в рабочем разведении по 100 мкл. Конъюгат представляет собой антитела диагностические против IgG(H+L) белой мыши, меченные пероксидазой (коммерческий препарат). Пластину инкубируют при 37°C в течение 1 ч, трижды отмывают. В заключение в лунки вносят по 100 мкл смеси перекиси водорода с хромогеном. Пластину помещают в защищенное от света место. Реакция фермент-субстрат длится не более 20-25 минут при комнатной температуре. Для ее остановки используют стоп-реагент. Результаты реакции (оптическую плотность (ОП) содержимого лунок) регистрируют на планшетном фотометре при длине волны, соответствующей характеристике применяемого хромогена. МКА 1E₂/E₅, выделяемые из асцитической жидкости, активны в разведениях 1:10⁵-5:10⁶.

Средний объем асцитической жидкости, получаемый от одной мыши при культивировании гибридомы CCHFV Vd-2 (1Е2/Е5) in vivo, - 3-4 мл, концентрация МКА - 8-10 мг/мл.

Пример 3. Проверка заявленных полезных свойств МКА 1E₂/E₅ в ИФА.

Для оценки целесообразности использования полученного МКА в качестве одного из реагентов в наборе для выявления антигенов вируса ККГЛ была изучена специфическая активность МКА 1E_2//E₅.

В качестве референс-препарата использованы слабые разведения образца, содержащего антигены вируса ККГЛ и один концентрированный образец, не содержащий их.

Образец 1. Рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности, аналогичные белкам вируса ККГЛ изолят «1-2»;

Образец 2. Отрицательный контроль - смесь лизатных белков перевиваемой линии клеток аденокарциномы надпочечников человека SV-13 и Е.coli (вероятные примеси образца №1).

Диагностическая конструкция построена по схеме прямого твердофазного трехстадийного ИФА разновидности двойной сэндвич. В нее включены два моноклональных компонента: планшет иммуносорбент с иммобилизованными на поверхности лунок МКА - к белкам вируса ККГЛ и конъюгат МКА-биотин, выявляющий образованные иммунные комплексы антител иммуносорбента с антигенами вируса ККГЛ. Для повышения чувствительности реакции обнаружения искомого антигена последовательно применены два конъюгата: МКА-биотин и образующий крепкую связь с ним стрептавидин-полипероксидаза хрена (СПХ, «STD GmbH», Германия). Последний состоит из одной молекулы стрептавидина и 800 молекул пероксидазы, его применение повышает чувствительность ИФА в 200-300 раз относительно классического конъюгата белок-фермент. Визуализация результатов анализа осуществляется добавлением к образовавшимся иммунным комплексам раствора хромогена 3,3′,5,5′-тетраметиленбензидина («Moss Inc», США) с последующей фиксацией окраски раствором серной кислоты и регистрацией на планшетном фотометре в единицах ОП.

Для активации иммуносорбента (96-луночный планшет из модифицированного полистирола, международная классификация «Maxisorp») был подобран состав сорбционного раствора. Для уменьшения фона в результатах анализа, а также придания иммуносорбенту стабильности при хранении, наиболее эффективным оказалось использование карбонатного буферного раствора с последующей блокировкой свободных участков пластика раствором казеина и сахарозы.

Полезные свойства МКА 1E_2//E₅ были изучены как применительно к активации им иммуносорбента, так и к использованию его в качестве компонента конъюгата МКА-биотин.

Для подбора оптимальной концентрации МКА в иммуносорбенте с целью выявления специфичного сигнала при низких концентрациях антигена вируса ККГЛ для МКА 1E_2//E₅ было приготовлено четыре 10-кратных разведения, начиная с 0,15 мкг в лунку. Оптимальная концентрация устанавливалась в ИФА.

Для получения конъюгата МКА-биотин была использована рутинная процедура биотинилирования: добавление к диализованным против гидрокарбонатного раствора МКА сульфо-NHS-биотина с последующей очисткой конъюгата от не связавшегося биотина гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25.

Оптимальная концентрация полученного согласно этой методике конъюгата МКА 1E_2//E₅-биотин была установлена в ИФА путем использования четырех последовательных отличающихся в 10 раз разведений биотинилированных МКА по отдельности, начиная с максимальной - 150 мкг/мл.

На первой стадии ИФА исходные образцы разводили в 100 раз раствором трис-ЭДТА с добавлением тритона X-100 и инкубировали в лунках иммуносорбента на основе различных концентраций МКА 1E_2//Е₅ 1 ч при 37°C. После пятикратной отмывки ФСБ-Т в лунки планшета вносили конъюгат МКА 1Е_2//Е₅-биотин и инкубировали 1 ч при 37°C. Затем после аналогичной отмывки в лунки планшета вносили раствор СПХ и инкубировали 1 ч при 37°C. На стадии визуализации иммунных комплексов в лунки планшета внесли раствор хромогена и инкубировали 15 мин при 37°C. Результаты учитывали при длине волны поглощения 450 нм. Для каждого значения ОП образца №1, содержащего антиген вируса ККГЛ, определяли коэффициент позитивности (Кпоз) как отношение его ОП к ОП отрицательного контроля №2 в каждой точке разведения МКА иммуносорбента и конъюгата.

Данные по определению оптимальных концентраций представлены в таблице 1. Эффективность выявления антигена вируса ККГЛ в образце №1 оценивали по максимальному показателю Кпоз МКА 1E₂/E₅-биотин (в единицах Кпоз).

Как видно из представленной таблицы 1, перспективным следует считать одновременное использование МКА 1E₂/E₅ для активации иммуносорбента в диапазоне концентраций 0,15-1,5 мкг/мл, а в качестве компонента конъюгата в рабочем разведении 15 мкг/мл. Полученные данные свидетельствуют о значимой авидности МКА 1E₂/E₅ к эпитопам белков вируса ККГЛ.

Таким образом, перечисленные выше свойства гибридомы-продуцента МКА позволили сделать следующее заключение. Штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus L. (авторское название клеточной линии CCHFV Vd-2) предназначен для получения моноклонального антитела 1E₂/E₅ к вирусу Крым-Конго геморрагической лихорадки, относящегося к классу IgG₁. Концентрация иммуноглобулинов в культуральной среде составляет 0,53 мкг/мл. Предложенный штамм является продуцентом моноклональных иммуноглобулинов - одного из компонентов тест-системы иммуноферментной для обнаружения вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки в пробах биологического материала.

Список использованных источников

1. Международные медико-санитарные правила (2005 г.). - 2-изд. - ВОЗ, 2008. - 90 с.

2. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.4.2318-08 «Санитарная охрана территории Российской Федерации».

3. Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство / Под ред. Г.Г. Онищенко. - М., 2006. - 288 с.

4. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. - М.: ОАО "Издательство "Медицина", издательство "Шико", 2009. - 472 с.

5. МУК 4.2.3007-12 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней».

6. Вышемирский О.И., Костиков М.А., Гордеева З.Е., Мельникова Е.Э., Свешникова Н.А., Гайдамович С.Л. / Выделение и идентификация шести штаммов вируса Крымской геморрагической лихорадки от больных в Таджикистане // ВИНИТИ, т.27, Вирусология, М., 1992. - с.53-57.

7. Вышемирский О.И. Анализ антигенной структуры штаммов вируса крымской-Конго геморрагической лихорадки с помощью моноклональных антител // Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.м.н. - М., 1993.

8. Гайдамович С.Я., Львова А.И., Обухова В.Р. и др. Антитела к арбовирусам в асците иммунизированных мышей // Вопр. вирусол. - 1969. - №6. - С.676-683.

9. Евченко Ю.М., Львов Д.К., Сысолятина Г.В. и др. Зараженность клещей Hyalomma marginatum Koch. 1844 вирусом Крымской-Конго геморрагической лихорадки в Ставропольском крае в эпидемический сезон 2000 г. // Вопр. вирусол. - 2001. - №4. - С.18-20.

10. Лаврова Н.А., Наволокин О.В. Твердофазный иммуноферментный метод для выявления арбовирусов и антител к ним // В сб.: Арбовирусы. - М., 1986. - С.146-153.

11. Antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of crimean-congo hemorrhagic fever using a novel monoclonal antibody / Saijo M., Tang Q., Shimayi В., Han L., Zhang Y., Asiguma M., Tianshu D., Maeda A., Kurane I., Morikawa S. // J. Med. Virol. - 2005. - V.77, №1. - P.83-88.

12. Blackburn N.K., Besselaar T.G., Shepherd A.J., Swanepoel R. Preparation and use of monoclonal antibodies for identifying Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Am. J. Trop Med. Hyg. - 1987. - V.37, №2. - P.392-397.