Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1-ГО ТИПА ИВ741 СУБТИПА АЕ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для получения диагностических и экспериментальных вакцинных препаратов.

ВИЧ-инфекция является одним из самых опасных и широко распространенных инфекционных заболеваний. Глобальное распространение, принявшее характер мировой эпидемии, сделало проблему ВИЧ-инфекции центральной проблемой мирового здравоохранения. Возникла необходимость в создании универсальной вакцины. В настоящее время проводятся испытания вакцинных препаратов, созданных на основе изолятов ВИЧ-1, относящихся к субтипу Е, доминирующему в Азии и на Африканском континенте [1, 2]. Помимо субтипа Е существует еще рекомбинантная форма ВИЧ - CRF01_AE. Впервые данная рекомбинантная форма была выделена на территории Юго-Восточной Азии [3, 4]. На территории нашей страны данная форма встречается редко - менее 1%, но учитывая высокую дивергентность ВИЧ, целесообразно для разработки диагностических и вакцинных препаратов использовать штамм субтипа CRF01_AE, циркулирующий на территории Российской Федерации [5, 6].

Задача изобретения - получение штамма вируса иммунодефицита человека, принадлежащего к субтипу АЕ, циркулирующему в настоящее время на территории РФ.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в использовании его для изучения антивирусного действия химиопрепаратов нового поколения и для создания вакцины.

Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ741 субтипа АЕ для диагностических и вакцинных препаратов, депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1186 от 01.07.11 и имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную на фигуре 1, хранится в коллекции вирусов НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.

Штамм вируса выделен из лимфоцитов периферической крови больного СПИД, не получавшего антиретровирусную терапию. При получении штамма использованы методы сокультивации лимфоцитов больного с лимфоцитами крови здорового донора, стимулированных митогеном, а также с человеческими перевиваемыми клеточными линиями.

Репродукция.

Штамм ВИЧ-1 ИВ741 обладает высокой репродуктивной активностью и реплицируется в лимфоцитах периферической крови, лимфобластоидных клеточных культурах МТ-4 и Jurkat. Репродукция вируса сопровождается характерным цитопатическим действием и синицитеобразованием. Штамм может поддерживаться длительное время при пассировании на клеточных линиях. Через 5-6 дней после инфицирования клеток вируссодержащей культуральной жидкостью инфицированная клеточная взвесь замораживается и после размораживания и осветления при 1000 об/мин вносится к свежим неинфицированным клеткам, в соотношении 1:10.

Инфекционный титр вируса определяли по 50% тканевой цитопатической дозе вируса на модели вышеуказанных клеточных культур в сравнении со штаммом-аналогом ВИЧ-1 LAV, который является первым изолятом ВИЧ-1, выделенным от больного СПИД [7]. Продуктивная активность штамма составляет 5,0-6,0 lg ТЦД50 (таблица 1).

Антигенные свойства.

ВИЧ-1 относится к семейству Retroviridae, род Lentivirus. Вирусы этой подгруппы являются оболочечными РНК-содержащими вирусами с размером частиц около 100-150 нм. В составе частиц обнаруживают не менее 6 основных структурных антигенов, обладающих иммуногенными свойствами, которые могут быть выявлены в инфицированных клетках с помощью различных иммунологических и вирусологических методов.

Иммунофлюоресценция. Исследование методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием сыворотки больного СПИД, содержащей антитела к ВИЧ-1, показало наличие антигенов ВИЧ-1 в 55-60% инфицированных клеток.

Иммуноблот. Исследование в иммуноблоте показало, что вирус обладает антигенными детерминантами, характерными для ВИЧ-1: 120/160, 65, 55, 41, 31, 24, 17 кД (таблица 2).

Субтипирование. Генетический анализ области, кодируемой геном pol, проведенный с помощью субтипспецифических праймеров (CCAAAGGTTAAACAATGG, TTAGATTCTTAAATGGCTCC) подходящих для изучения вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории России, показал, что данный штамм вируса относится к субтипу АЕ.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Сравнительное исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ741 по цитопатическому действию.

Исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ проводили на модели лимфобластоидных клеток МТ-4 и Jurkat в пластиковой 24-луночной панели (Costar, США). Клетки инфицировали вирусом в дозе 0,01 инфекционных единиц на клетку. Далее, инкубировали культуры клеток при 37С° в течение 1 часа и дважды отмывали. После этого к культуре клеток добавляли питательную среду RPMI-1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства Sigma) и 100 мкг/мл гентамицина (конечная концентрация клеток 400000 клеток/мл). Учет результатов противовирусной активности производили по жизнеспособности клеток путем окрашивания клеток красителем трипановым синим на 6-7 сутки. За титр вируса принимали величину, обратную его максимальному разведению, вызывающему как минимум двухкратное превышение показателя гибели клеток по сравнению с контролем. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Сравнительный анализ показал, что инфекционные титры штамма ИВ741 сопоставимы с инфекционным титром штамма-аналога LAV, что свидетельствует об их сходной активности. Данный инфекционный титр позволяет успешно инфицировать лимфобластоидные клеточные культуры, с целью дальнейшей наработки инфекционного материала.

Пример 2. Диагностика антител к ВИЧ-1 методом иммуноблота.

Материал для исследования антител к ВИЧ-1 представлен 10 сыворотками, полученными от ВИЧ-инфицированных лиц и содержащих анти-ВИЧ антитела. Сыворотки были предварительно охарактеризованы в коммерческой тест-системе фирмы «Биорад» (США). В качестве антигена использован штамм ИВ741 и штамм-аналог LAV. Выявление антител к ВИЧ-1 проводили с помощью нитроцеллюлозных стрипованных мембран (стрип), с нанесенными на них антигенами ВИЧ-1, фирмы «Биорад» (США). Готовую стрипованную мембрану предварительно замачивали на 5 мин в фосфатно-солевом буфере с твином (ФСБ-Т). Сыворотку крови в количестве 20 мкл разводили в 1 мл ФСБ-Т, содержащего 0,5% БСА (бычий сывороточный альбумин) и вносили в лунку со стрипом. После инкубации в течение 1 час при комнатной температуре и отмывки ФСБ-Т вносили конъюгат, разведенный в 1 мл ФСБ-Т. Далее снова проводили инкубацию в течение 1 час при комнатной температуре и после отмывки ФСБ-Т вносили 1 мл раствора тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратно-фосфатном буфере (ЦФБ). Затем инкубировали в темноте до появления четких полос в контрольном стрипе. Реакцию останавливали 1 н. серной кислотой. После промывки стрипа дистиллированной водой его высушивали при комнатной температуре и визуально проводили учет результатов.

Результаты исследований представлены в таблице 2. В результате проведенных исследований установлено, что антиген штамма ИВ741 позволяет выявлять антитела ко всем основным структурным белкам ВИЧ-1 и, следовательно, может быть использован для изучения сероконверсии лиц, инфицированных ВИЧ-1, а также для изучения противовирусного действия химиопрепаратов и создания вакцины против ВИЧ.

Пример 3. Сравнительный анализ инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ741 по уровню антигена вируса (р24).

Определение уровня вирусного антигена в вируссодержащей жидкости проводили с помощью иммуноферментного анализа, с использованием коммерческого иммуноферментного набора фирмы Биорад (США) на 96-луночных панелях. В лунки, в которые предварительно был внесены исследуемые образцы, добавляли конъюгат, содержащий биотилинированные поликлональные антитела к р24 ВИЧ-1. После инкубации в течение 1 часа при 37°С панель отмывали трис-солевым буфером и вносили стрептавидин-пероксидазный конъюгат. Проводили инкубацию в течение 30 мин при комнатной температуре, отмывали панель трис-солевым буфером и затем для визуализации реакции добавляли тетраметилбензидин (ТМБ). После инкубации в течение 30 минут в темноте, при комнатной температуре в лунки для остановки реакции вносили 1 н. серную кислоту. Результаты учитывали с помощью фотометра "Multiscan" при длине волны 630 нм. За положительный контроль принимали не менее чем 3-кратное превышение оптической плотности по сравнению с таковым показателем неинфицированной клеточной линии.

Результаты исследований представлены в Таблице 3. В результате проведенных исследований установлено, что штамм ИВ 741 не уступает по уровню выработки антигена ВИЧ-1, штамму-аналогу LAV и обладает высокой репродуктивной активностью, что позволяет успешно инфицировать им лимфобластоидные клеточные культуры, с целью дальнейшей наработки инфекционного материала.

Источники информации

1. Spira S., Wainberg M.A., Loemba H. et al. Impact of clade diversity on HIV-1 virulence, antiretroviral drug sensitivity and drug resistance // J. Antimicrob. Chem. - 2003. - V.51. - P.229-240.

2. Kathy Stover. "In Thailand Clinical Study, HIV Vaccine Regimen Demonstrates Modest Preventive Effect." Medical News Today. MediLexicon, Intl., 25 Sep. 2009. Web. 22 Jun. 2012. http://www.medicalnewstoday.com/releases/165277.php.

3. Gao F., Robertson D.L., Morrison S.G. et al. The heterosexual human immunodeficiency virus type 1 epidemic in Thailand is caused by an intersubtype (A/E) recombinant of African origin// J. Virol. - 1996. - V.70. - P.7013-7029.

4. McCutchan F.E., Hegerich P.A., Brennan T.P. et al. Genetic variants of HIV-1 in Thailand// AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 1992. - V.8. - P.1887-1895.

5. Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Selimova L. et al. Genetic heterogeneity of HIV type 1 in Russia: identification of H variants and relationship with epidemiological data. AIDS 1996; 12:1687-1690.

6. Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Selimova L. et al. HIV type 1 subtype E in Russia. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1997; 13:725-727.

7. Barre-Sinoussi F., Mugeyre M., Dauguet C. Isolation of a T-lymphotropic retroviruses from a patient at risk for AIDS // Science. - 1983. - Vol.220. - P.868-871.