Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ HELICOBACTER PYLORI-ИНФЕКЦИЕЙ

Изобретение относится к иммунодиагностике хронических персистирующих заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), в частности к неинвазивным методам иммунодиагностики заболеваний, вызванных Helicobacter pylori-инфекцией у лиц с аллергическими заболеваниями.

Способ основан на количественном определении специфических IgE (slgE) к Helicobacter pylori методом твердофазного иммуноферментного анализа, при котором у исследуемого лица получают сыворотку крови, в которой определяют уровень slgE к Helicobacter pylori с использованием цельного антигена Helicobacter pylori, сорбированного на полистероловом планшете, и конъюгата моноклональных антител к IgE с пероксидазой хрена, и количественное определение содержания slgE к Helicobacter pylori осуществляют при помощи набора специфических IgE референс реагентов. Способ информативен и достоверен.

Из существующих методов иммунодиагностики заболеваний, вызванных Helicobacter pylori-инфекцией, известны методы, позволяющие обнаружить антитела против возбудителя классов G-, А- и М- (Granberg С. et all, 1993; Crabtree J.E. et all, 1991; van den Oever H.L. et all, 1991; Peña A.S., et all, 1989).

Антитела класса IgG начинают вырабатываться через 3-4 недели после инфицирования вслед за IgM антителами (которые исчезают через несколько недель после первого контакта с возбудителем инфекции).

Инфекция Helicobacter pylori обычно не проходит самопроизвольно, возбудитель может присутствовать в течение всей жизни человека. IgG-антитела к нему выявляются в сыворотке крови многие годы, являясь индикатором инфицирования. Высокие титры антител к Helicobacter pylori в крови сохраняются некоторое время после эрадикации микроорганизма.

На сегодняшний день принято считать, что "отсутствие специфических IgG позволяет с высокой степенью достоверности отвергнуть диагноз Helicobacter pylori-ассоциированного гастрита или язвы", хотя их присутствие не является абсолютным доказательством данного заболевания.

Антитела класса IgA также появляются через 2-3 недели после контакта с Helicobacter pylori. Этот тип антител (секреторные антитела) характерен больше для слизистых оболочек, где они образуются локально и обеспечивают местную защиту. IgA-атитела не всегда обнаруживаются в крови. Выявление IgA к Helicobacter pylori коррелирует с активностью гастрита, считается, что повышенный титр IgA может выполнять роль маркера хронической инфекции.

Недостатком данного способа иммунодиагностики является выраженный дозо-зависимый эффект IgG- IgA- IgM-иммунного ответа. В случаях субклинического течения хеликобактерной инфекции (особенно у не леченных больных) антигенная стимуляция может быть недостаточной для определяемых уровней антител указанных классов. Иммуноглобулин Е (IgE), филогенетически более древний иммуноглобулин, осуществляющий защиту слизизистых оболочек и, в отличие от других изотипов, инициируется низкими дозами естественно секретируемых антигенов персистирующими микроорганизмами, к которым относится и Helicobacter pylori. При хронической персистенции Helicobacter pylori уровень slgE может быть более высоким, чем уровни антител других изотипов.

Важно отметить, что у лиц, предрасположенных к аллергии, синтез slgE обеспечивает атопическую направленность иммунного ответа, который может существенно усиливаться при воздействии бактериальных антигенов.

В доступной литературе мы не встретили работ о тест-системах, позволяющих определять количественное содержание slgE к антигенам условно-патогенных бактерий, в том числе к антигенам Helicobacter pylori.

Задачей, на решение которой направлено заявленное изобретение, является улучшение качества диагностики заболеваний, вызванных Helicobacter pylori-инфекцией у лиц с аллергическими заболеваниями с помощью выявления специфических иммуноглобулинов класса Е (slgE).

Предлагается способ, в котором у исследуемого лица получают сыворотку крови, в полученной сыворотке определяют уровень slgE к Helicobacter pylori методом иммуноферментного анализа с использованием цельного антигена Helicobacter pylori, сорбированного на твердой фазе, в качестве конъюгата - моноклональные антитела к IgE 8E/4F4, меченные пероксидазой хрена в разведении 1:3000, причем определение содержания slgE к Helicobacter pylori проводят параллельно с определением количественного содержания slgE в наборе специфических IgE-референс реагентов; при положительном значении slgE к Helicobacter pylori устанавливают наличие Helicobacter pylori-инфекции у исследуемого лица.

Предложенный способ реализуется следующим образом.

1. Получение сыворотки.

У больного из кубитальной вены забирают в центрифужную пробирку 10,0 мл крови, оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Затем стеклянной палочкой отводят сгусток (для более полной ретракции) и помещают в термостат при температуре 37°С на 1,5 ч. Кровь центрифугируют со скоростью 3000 оборотов в 1 мин в течение 15 мин, сыворотку отсасывают автоматической пипеткой. Полученную сыворотку хранят при температуре минус 30°С в холодильнике

2. Подготовка реагентов.

В качестве антигена используют Helicobacter pylori, сорбированный на твердой фазе, а в качестве конъюгата - моноклональные антитела к IgE 8E/4F4, меченные пероксидазой хрена в разведении 1:3000.

В качестве референс-реагентов используют референс-стрипы и калибровочные образцы с известным содержанием slgE из набора специфических IgE референс реагентов фирмы "Dr. Fooke".

3. Проведение иммуноферментного анализа.

3.1. Все лунки планшета и референс-стрипа промывают 2 раза по 3 мин фосфатно-солевым буферным раствором с содержанием 0,05% ТВИН-20 (ФСБ-Т).

3.2. В каждую лунку вносят по 10 мкл исследуемых образцов сыворотки крови человека и по 9Q мкл фосфатно-солевого буферного раствора, рН 7,3-7,4 (ФСБ). Параллельно в референс-стрипы вносят по 10 мкл калибровочных образцов и по 90 мкл ФСБ, рН 7,3-7,4. Инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 1 часа.

3.3. Сыворотку и калибровочные образцы удаляют, лунки промывают 3 раза по 3 мин раствором ФСБ-Т.

3.4. После отмывания связавшиеся с антигеном антитела детектируют с помощью пероксидазного конъюгата моноклональных антител к IgE (8E/4F4 1000х) в разведении 1:3000. Инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 1 часа.

3.5. Затем раствор конъюгата удаляют, лунки промывают 4 раза по 3 мин раствором ФСБ-Т и 1 раз дистиллированной водой.

3.6. Пероксидазную реакцию проявляют добавлением субстратной смеси, содержащей 0,1 мг/мл 3,3',5,5' - тетраметилбензидина (ТМБ) и 0,02% Н₂О₂ в ацетат-цитратном буфере, рН 5,0.

В момент появления окраски реакцию останавливают добавлением 1н серной кислоты. Учет результатов проводят на приборе "Anthos-2010" (Австрия) при длине волны 450 нм.

4. Количественное содержание slgE к Helicobacter pylori осуществляют с помощью кривой, полученной по данным оптической плотности калибровочных образцов с известным содержанием slgE.

5. Наличие Helicobacter pylori-инфекции у исследуемых лиц подтверждается положительным выявлением slgE к Helicobacter pylori в сыворотке крови.

Пример 1.

У 69 детей с гастродуоденальной патологией получали сыворотку крови, в которой определяли уровень slgE к Helicobacter pylori путем твердофазного иммуноферментного анализа с использованием цельного антигена Helicobacter pylori, и конъюгата моноклональных антител к IgE с пероксидазой хрена, и количественное содержание slgE к Helicobacter pylori осуществляли при помощи набора специфических IgE референс реагентов. Далее анализировали каким образом обнаружение антихеликобактерных slgE соотносится с данными уреазных методов диагностики Helicobacter pylori-инфекции.

У H.pylori - серонегативных лиц положительная уреазная активность отмечалась в 33% случаев, в то время как у H.pylori - IgM-, IgG-, IgA-серопозитивных лиц совпадение с положительной уреазной активностью отмечено в 73,5%. При обнаружении антихеликобактерных slgE совпадение с положительной уреазной активностью достигало 92%. При этом наличие в сыворотке крови только slgE к H.pylori, при отсутствии антител других изотипов, было ассоциировано с более высокой частотой (94%) положительных уреазных тестов.

Пример 2.

Принципиальное значение для практики имеет проведение диагностики Helicobacter pylori-инфекции до лечения, т.е первичная диагностика. Экспресс-тесты, к которым в первую очередь относится серологический метод, могут быть использованы для удешевления процесса первичной диагностики Helicobacter pylori-инфекции, так как положительный результат теста в ясной клинической ситуации позволяет исключить дорогостоящие бактериологическое / гистологическое / ПЦР исследования. Поскольку инфекция является хронической и ее спонтанный клиренс невозможен, то положительные серологические тесты у не леченных пациентов указывают на наличие текущей инфекции.

Больная М., 12 лет, поступила в отделение гастроэнтерологии ДГБ №1 г. Ульяновска с диагнозом: Хронический эрозивный гастродуоденит, обострение. Диагноз установлен впервые на амбулаторном этапе на основании жалоб, анамнеза, физикальных методов исследования, подтвержден эндоскопически без взятия биопсии на наличие Helicobacter pylori. Для решения вопроса о необходимости проведения эрадикационной терапии принято решение использовать два (в соответствии с Маастрихтским соглашением) неинвазивных метода диагностики Helicobacter pylori: дыхательный тест и серологическое исследование, для того чтобы исключить необходимость повторного эндоскопического исследования для взятия биопсии. Результаты исследований: серологические данные - антитела к H.pylori IgA - 0; IgM - 0; IgG - 0; slgE - 5,14 МЕ/мл. Дыхательный тест ++. Таким образом, подтверждена инвазия Helicobacter pylori, назначена эрадикационная терапия. Состояние больной на фоне проводимого лечения показало положительную клиническую динамику. Контрольное эндоскопическое исследование через месяц зафиксировало полную эпителизацию эрозивных поверхностей.

Пример 3.

Больная К., 14 лет, с диагнозом: рецидивирующая идиопатическая крапивница, прошла комплексное обследование по поводу основного заболевания. По результатам эзофагогастродуоденоскопии диагностирован хронический гиперпластический гастродуоденит в стадии неполной ремиссии. Быстрый уреазный метод выявления Helicobacter pylori оказался положительным. Поскольку инфекция Helicobacter pylori является фактором риска развития хронической крапивницы, для начала проведения эрадикационной терапии требовался второй метод диагностики для подтверждения инфекции согласно стандартам. По результатам серологического метода выявления: антитела к H.pylori IgA - 0; IgM - 0; IgG - 0; slgE - 4,1 МЕ/мл.

Таким образом, персистирующая Helicobacter pylori-инфекция подтверждена. Назначена эрадикационная терапия, после которой динамическое наблюдение за пациенткой в течение года показало отсутствие обострений крапивницы.

Рассмотренный способ иммунодиагностики может быть рекомендован в клиническую практику.