СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ РЕЦИДИВА ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, гастроэнтерологии и может быть применено для прогнозирования развития рецидива неспецифического язвенного колита или болезни Крона по результатам иммуноферментного определения в крови и образцах кала антимикробных пептидов.

В описании изобретения к патенту «Полипептиды с противомикробной активностью и кодирующие их полинуклеотиды» (патент РФ №2393224, опубл. 27.06.2010) дана характеристика различных классов дефензинов, их способности вызывать гибель или ингибировать рост микробных клеток. В патенте указано, что полипептиды с противомикробной активностью обладают способностью снижать количество живых клеток Escherichia coli (DSM 1576) и Bacillus subtilis (АТСС 6633) до 1/100 через 8 часов, ингибировать рост Escherichia coli (DSM 1576) и Bacillus subtilis (АТСС 6633) в течение 24 часов при 25°C в субстрате для микробного роста, что может быть использовано в качестве лечебного или профилактического средства для больного с инфекционной патологией.

В исследованиях других авторов (Вахрамеева Т.Н., Бедарева Т.Ю. «Дефензины как маркер системной активации нейтрофилов при клещевых нейроинфекциях» // Медицина в Кузбассе. -2008. - №3. - С.15-19) было доказано, что в динамике инфекционного заболевания уровень дефензинов соответствовал клинической выраженности общеинфекционного синдрома: в остром периоде уровень дефензинов повышался, при микст-инфекциях отмечалось более высокое содержание дефензинов в сравнении с моноинфекциями. При этом, развивающиеся воспалительные изменения в ликворе коррелировали с ростом уровня дефензинов. В период регресса общеинфекционных проявлений количество дефензинов при менингеальной форме клещевого энцефалита значительно снижалось, достигая практически нормальных показателей. Таким образом, авторы делают вывод о возможности определения концентрации дефензинов в крови как биоцидных продуктов нейтрофилов для объективизации тяжести течения инфекции.

Известен способ определения в кале кальпротектина (связанный с кальцием протеин, содержащийся в нейтрофильных гранулоцитах) как маркера воспаления слизистой оболочки толстой кишки («Fecal sample test device and methods of use», US, 7780915, 24.08.2010). В описании изобретения к патенту указано, что содержание кальпротектина ниже 50 мкг/г свидетельствует об отсутствии воспаления слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. Однако, автор не указывает возможностей для оценки активности воспалительного процесса и его ремиссии.

В исследовании других авторов представлено, что фекальный кальпротектин отражает активность воспалительного процесса у детей с воспалительными заболеваниями кишечника (Татьянина О.Ф., Потапов А.С., Намазова-Баранова Л.С., Цимбалова Е.Г., Кучеренко А.Г. Возможности кальпротектина в диагностике воспалительных заболеваний кишечника у детей // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2009. - №1. - С.42-48). При ремиссии неспецифического язвенного колита содержание фекального кальпротектина составило 94,43±13,23 мкг/г, при низкой и высокой клинической активности заболевания, соответственно, 193,14±24,02 мкг/г и 253,17±26,85 мкг/г. Однако, содержание кальпротектина в стуле у детей имеет отличительные особенности по сравнению со взрослыми пациентами, что требует изучения проблемы в различные возрастные периоды.

Известен также способ определения степени активности неспецифического язвенного колита у детей (патент РФ №2391669, опубликован 10.06.2010). Способ включает определение степени активности неспецифического язвенного колита у детей по содержанию коллагена IV типа в крови. При значении последнего в пределах от 53 до 104 мкг/л в сыворотке крови определяют 1 степень, от 104 до 201 мкг/л - 2 степень, от 201 мкг/л и выше - 3 степень активности колита.

Известен также способ определения показаний к иммунологической коррекции болезни Крона и неспецифического язвенного колита (патент РФ №2258223, опубл. 10.08.2005), согласно которому уточняют содержание сывороточных фактора некроза опухоли-α, интерлейкина-6, интерлейкина-12 до и после введения препарата ремикейда в дозе 4-6 мг/кг и при снижении содержания сывороточного фактора некроза опухоли-α вдвое и интерлейкина-6 на 37% и более и при повышении уровня интерлейкина-12 на 230-250%, считают иммунологическую коррекцию болезни Крона и неспецифического язвенного колита доказанной. Таким образом, по содержанию в крови иммунологических факторов судят о степени активности заболевания и наступлении ремиссии.

Общим недостатком приведенных способов является то, что определение маркеров воспаления в крови, в частности, у взрослых пациентов с возможной коморбидной воспалительной патологией, характеризует общую характеристику заболевания, а не локальный статус активности воспаления. Определение факторов, отражающих степень активности воспалительного процесса в биоптате слизистой толстой кишки при эндоскопическом исследовании травматично и инвазивно, не может использоваться часто, а при измерении концентрации маркеров воспаления в кале следует учитывать протеолитическую активность фекальных ферментов. Быстрое разрушение интерлейкинов, фактора некроза опухоли-α, коллагена IV протеолитическими ферментами, содержащимися в кале, препятствует их широкому использованию в клинической практике.

Выходом из сложившейся ситуации является определение антимикробных пептидов в кале с одновременным определением их в крови, так как они не подвержены воздействию протеолитических ферментов, сохраняются в образцах стула в течение 7 дней при комнатной температуре, а для исследования методом иммуноферментного анализа (ИФА) требуется небольшое количество образца до 50 мг.

Задачей заявляемого изобретения является оценка вероятности развития рецидива у больных с воспалительными заболеваниями кишечника по результатам анализа содержания в крови и кале комплекса антимикробных пептидов.

Указанная задача достигается тем, что у больных с воспалительными заболеваниями кишечника с помощью ИФА в крови определяют уровень α-дефензина, а в кале - содержание β-дефензина и кальпротектина. Полученные значения подставляют в математическую формулу линейной множественной регрессии и рассчитывают прогнозируемую величину вероятности развития рецидива язвенного колита в %. Если вероятность равна 50% и более, то у пациента риск развития рецидива высокий и необходима модификация лечения. Если вероятность развития рецидива менее 50%, то состояние больного классифицируется как ремиссия, что не требует дополнительного обследования больного и изменения лечения.

Новизна изобретения состоит в том, что одновременная оценка сразу трех антимикробных пептидов как в крови, так и в кале, позволяет повысить чувствительность прогноза диагностики обострения воспалительных заболеваний кишечника, более точно отражает изменение активности заболевания.

Изобретение имеет изобретательский уровень, так как для специалиста-гастроэнтеролога явным образом не следует из уровня медицины в данной области клинической практики.

В доступных источниках информации России и зарубежных не обнаружено аналогичного предлагаемому способа прогнозирования обострения у больных с воспалительными заболеваниями кишечника.

Заявляемое изобретение является промышленно применимым, так как может быть многократно повторено и использовано при оценке вероятности развития рецидива у больных с воспалительными заболеваниями кишечника, и воспроизведено в различных лечебно-профилактических и научных медицинских учреждениях, особенно гастроэнтерологического и терапевтического профиля.

Способ прогнозирования рецидива у больных с воспалительными заболеваниями кишечника, осуществляется следующим образом.

У больных с установленным диагнозом неспецифического язвенного колита или болезнью Крона забирают образцы венозной крови и кала. Содержание осдефензина в плазме крови определяют с помощью иммунофер-ментного анализа (ELISA) и стандартных диагностических наборов в нг/мл. Контролем служит HNP-1 (human neutropil peptide-1). Плазму получают путем центрифугирования при 3000 об/мин крови, взятой с консервантом (3,8% цитрат натрия) в соотношении 9:1.

Образец кала собирают в чистую пробирку. С помощью специального устройства для экстракции экстрагируют 50-100 мг исходного образца кала для определения кальпротектина. Возможно хранение при температуре 2-8°C в течение 6 дней. Количественное определение содержания кальпротектина в образцах стула проводят иммуноферментным анализом (ELISA) с помощью стандартных наборов. Преаналитический этап заключается в предварительной процедуре экстракции образцов. В пустую полипропиленовую пробирку помещают 50-100 мг образца кала и 2,5-5,0 мл буферного раствора для экстракции (1 объем кала к 49 объемам буферного раствора). Смесь в течение 30 мин энергично встряхивают на вортексе, затем 1,5 мл гомогената переносят в чистую пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 10000 g. Полученный супернатант помещают в чистую пробирку и хранят при 20°C до проведения ИФА (экстракты стабильны в течение 4 мес.). Дальнейшее тестирование проводят с помощью ИФА, результаты регистрируют на микропланшетном фотометре при длине волны 450 нм. Расчет концентрации кальпротектина производят с помощью калибровочной кривой. Концентрацию ФК выражают в мкг кальпротектина на 1 г фекалий.

Уровень β-дефензина в кале также определяют с помощью иммуноферментной тест-системы для количественного определения анализируемого вещества в кале в нг/г.

Найденные величины содержания пептидов в биологических средах подставляют в формулу линейной множественной регрессии, полученную методом множественной регрессии, и рассчитывают вероятность развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника в %:

р=(0,0014·βД+0,0005·αД+0,002·ФК-0,4)·100%,

где р - вероятность развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника в %;

βД - содержание β-дефензина в кале в нг/г;

αД - содержание α-дефензина в крови в нг/мл;

ФК - содержание кальпротектина в кале в мкг/г.

Если вероятность развития рецидива равна 50% и более, то у пациента риск развития рецидива высокий и необходима оптимизация лечения. Если вероятность развития рецидива менее 50%, то состояние больного расценивается как состояние ремиссии, что не требует дополнительного обследования и продолжения лечения.

При проведении ROC-анализа были определены диагностические точки разделения для уровней β-дефензина, α-дефензина и кальпротектина с целью дифференцирования состояний рецидива болезни и ремиссии. У больных с воспалительными заболеваниями кишечника рецидив развивался при превышении содержания β-дефензина в кале более 213 нг/г (диагностическая чувствительность - 78%, диагностическая специфичность - 85%), α-дефензина в крови - более 312 нг/мл (диагностическая чувствительность - 71%, диагностическая специфичность - 88%), кальпротектина в кале - более 232 мкг/г (диагностическая чувствительность - 82%, диагностическая специфичность - 89%). Вероятность развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника при достижении указанных диагностических точек разделения трех антимикробных пептидов равна 50%.

При превышении уровней сразу трех антимикробных пептидов в биологических жидкостях диагностическая чувствительность возрастала до 87%, а диагностическая специфичность составила 92%.

Практическое применение заявляемого способа иллюстрируется примерами из клинической практики.

ПРИМЕРЫ:

Пример 1. Больная С., 32 лет. Находилась на обследовании и лечении в отделении гастроэнтерологии. Диагноз: язвенный колит, левосторонняя форма, рецидивирующие течение, средней тяжести, высокой степени активности, стадия обострения.

Жалобы на частый жидкий стул (до 9 раз в сутки) с примесью крови и слизи, субфебрильную лихорадку, тенезмы, переодические боли схвадкообразного характера в левом фланке живота, потерю веса 6 кг за последние 1,5 месяца, общую слабость. Болеет 10 лет. Обострения 2-3 раза в год. Получала препараты 5-АСК, микроклизмы с гидрокортизоном. Последние месяцы принимала 5 мг преднизолона (отменен около 3 недель назад).

Объективно. Удовлетворительного питания, кожные покровы и видимые слизистые бледные. Язык густо обложен белым налетом. Сердце, легкие без отклонений от нормы. Живот болезненный при пальпации по ходу нисходящего отдела толстой кишки. Печень, селезенка пальпаторно не увеличены.

Общий анализ крови: эритроциты 2,94×10¹²/л, Hb 87 г/л, лейкоциты 8,2×10⁹/л, тромбоциты 230×10⁹/л, эозинофилы 2%, сегментоядерные нейтрофилы 69%, палочкоядерные 4%, лимфоциты 22%, моноциты 3%. СОЭ 20 мм/ч. Общий анализ мочи без патологии. Общий белок 78 г/л. Билирубин общий 10,78 мкмоль/л, СРБ (+), сиаловые кислоты 200 ед., фибриноген 6,95 г/л, глюкоза крови 4,7 ммоль/л, АлАТ 11 Ед/л, АсАТ 15 Ед/л, сывороточное железо 11,9 мкмоль/л, кальций сыворотки 2,3 ммоль/л, калий - 4,9 ммоль/л. Простейшие в кале не обнаружены, выявлен дисбактериоз кишечника 2 степени.

Ирригоскопия: кишка несколько укорочена, левая половина лишена гаустр. Контур кишки деформирован, складки сглажены. Колоноскопия: в нисходящем отделе ободочной кишки визуализируются единичные воспалительные полипы 0,3-0,6 см в Д с ярко красной верхушкой и наложением фибрина, подслизистые геморрагии и эрозии. Слизистая рыхлая, легко кровоточит. Сосудистый рисунок отсутствует. Гистологически: обильная лимфоцитарно-нейтрофильная инфильтрация собственной пластинки с очагами деструкции. Снижение количества бокаловидных клеток, нарушение архитектоники железистого эпителия.

Результаты изучения содержания антимикробных пептидов при обострении: β-дефензин в кале 278 нг/г, α-дефензин в крови 485 нг/мл, кальпротектин в кале 312 мкг/г. Вероятность рецидива - 85,5% (более 50%).

Больной был назначен салофальк в дозе 4 г/сут (3 г внутрь и 1 грамм ректально в виде свечей). Клинические симптомы исчезли через 3 недели. Поддерживающая терапия составляла 3 г салофалька в сутки. Через каждые 2 мес.мониторировали содержание антимикробных пептидов в крови и кале. Через 2 мес. β-дефензин в кале 175 нг/г, α-дефензин в крови 289 нг/мл, кальпротектин в кале 86 мкг/г.Вероятность рецидива - 16,1% (менее 50%).

На 4 мес. β-дефензин в кале 238 нг/г, α-дефензин в крови 406 нг/мл, кальпротектин в кале 244 мкг/г. Вероятность рецидива - 62%. Поскольку вероятность рецидива возросла более 50%, то это потребовало увеличения суточной дозы салофалька до 4 г/сутки. Дальнейший мониторинг за больной в течение 8 месяцев наблюдения констатировал наступление ремиссии Ж.

Пример 2. Больной Б., 31 года. Статус через 6 мес. после выписки из гастроэнтерологического отделения. Диагноз: язвенный колит, левосторонняя форма, рецидивирующие течение, средней тяжести, низкой степени активности, ремиссия. Болеет в течение 9 лет. Находится на поддерживающей терапии салофальком 2,5 г в сутки.

Жалоб не предъявляет.

Объективно: удовлетворительного питания. Кожа и видимые слизистые розовые. Язык умеренно обложен белым налетом у корня. Тоны сердца звучные, пульс 76 в 1 минуту, ритмичный, АД 110/70 мм рт.ст. В легких дыхание везикулярное. Живот мягкий, безболезненный. Печень, селезенка не увеличены.

Общий анализ крови: эритроциты 4,1×10¹²/л, Hb 147 г/л, лейкоциты 6,9×10⁹/л, тромбоциты 280×10⁹ /л, эозинофилы -0, сегментоядерные нейтрофилы 65%, палочкоядерные - 1%, лимфоциты 29%, моноциты 4%. СОЭ 12 мм/ч. Общий анализ мочи без патологии. СРВ (-), церулоплазмин 2,0 ммоль/л, сиаловые кислоты 100 ед, фибриноген 3,87 г/л. Общий белок 82 г/л. Билирубин общий 16,7 мкмоль/л, глюкоза крови 4,6 ммоль/л, АлАТ 11 Ед/л, АсАТ 14 Ед/л, сывороточное железо 11,9 мкмоль/л. Микроэлементы плазмы: Ca, Na, K, Mg в норме. Простейшие в кале не обнаружены, выявлен дисбактериоз кишечника 2-й степени.

Результаты изучения содержания антимикробных пептидов: (3-дефензин в кале 164 нг/г, β-дефензин в крови 189 нг/мл, кальпротектин в кале 112 мкг/г. Вероятность рецидива - 14,8%). Поскольку вероятность рецидива низкая (менее 50%), то поддерживающая терапия оставалась прежней. Рецидива в последующие 6 мес.наблюдения не возникало.

Технико-экономическая эффективность заявляемого способа заключается в том, что высокая прогностическая вероятность развития рецидива у больных воспалительными заболеваниями кишечника позволяет провести своевременную профилактику и лечение патологии, что способствует снижению риска инвалидизации пациента и потери им своего социального и трудового потенциала. Исследование безопасно, инвазивные вмешательства (забор крови из вены и кала) минимальны, доступно для профильных учреждений здравоохранения, нетрудоемкое, затраты на оборудование и обучение персонала минимальные.