СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕРОЯТНОСТИ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ВРОЖДЕННЫХ ПОРОКОВ РАЗВИТИЯ ПЛОДА У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН

Настоящее изобретение относится к области медицины, иммунологии и генетики человека и может быть использовано для оценки индивидуального риска возникновения врожденных пороков развития плода.

Известен способ прогнозирования патологии внутриутробного развития опорно-двигательного аппарата плода (заявка RU 95121435/14, Кл. G01N 33/48, опубл. 27.02.1998). Методика осуществляется следующим путем: натощак производят забор 10 мл крови из локтевой вены беременной в сроке 6-8 недель беременности. Определяют 10 биохимических показателей крови: содержание α-липопротеидов, билирубина (общего и свободного), холестерина, активность креатинкиназы, кислой и щелочной фосфатаз, аланинаминотрансферазы, РНК-азы, катепсина Д. Каждому показателю в зависимости от его количественного значения присваивают прогностический коэффициент, все коэффициенты суммируют. При суммарном коэффициенте равном от +6 до +25 прогнозируется развитие патологии опорно-двигательного аппарата плода; от +13 до -16 - развитие патологии исключается; а при значениях коэффициента 14 или 15 прогнозируют наличие риска внутриутробного развития патологии опорно-двигательного аппарата плода. Недостатками данного способа являются узконаправленное прогнозирование внутриутробных пороков лишь одной системы органов и отсутствие прогнозирования аномалии развития других систем, а также сложности выполнения и интерпретации результатов ввиду большого количества определений показателей. Кроме того, этот метод не раскрывает этиологических и патогенетических механизмов врожденных пороков развития и потому мало перспективен для дальнейшей разработки методов профилактики врожденных пороков развития плода (ВПРП).

Известен также способ скринингового обследования женщин для прогноза развития эмбриона/плода и рождения здорового либо аномального ребенка (патент G01N 33/53, опубл. 27.03.1998). Суть метода заключается в том, что у женщин детородного возраста с ранними сроками беременности или до беременности осуществляют забор крови, из которой получают сыворотку, затем получают тест-систему HLI-P (очищенные тест-антигены) и проводят твердофазный иммуноферментный анализ, определяют иммунореактивность сывороточных аутоантител организма женщины, оказывающих существенное влияние на нормальный эмбрио/фетогенез и направленных к антигенам, участвующим в процессах развития органов и тканей плода, например, к основному белку миелина, белку S100, анионному прочносвязанному белку хроматина АБХ 14-18, мембранному белку МР65 и при получении данных об отклонении иммунореактивности тестируемых сывороток от уровня нормальных значений к любому из них, по степени выраженности отклонений определяют уровень риска нарушений развития плода. Недостатками данного способа являются: сложность выполнения, многостадийная методика получения посадочных белков, необходимость эталонной сыворотки. Неблагоприятным является также разведение конъюгатов в отмывочном растворе вместо белкового раствора, поддерживающего естественное осмотическое давление.

Кроме того, известен способ предупреждения и снижения риска потери беременности по трем протеинам: аполипопротеину В-100, альфа2макроглобулину (альфа2М) и фибронектину (патент WO 2011/112993 A3, опубл. 15.09.2011). Суть метода заключается в том, что определяют уровень материнских IgG-антител к трофобласт-продуцируемому фибронектину и/или аполипопротеину В-100, и/или отсутствие или недетектируемый уровень антител к альфа2М, что ассоциировано с риском потери беременности.

Наиболее близким способом определения вероятности возникновения ВПРП может служить способ молекулярного анализа генетических полиморфизмов ферментов биотрансформации низкомолекулярных органических соединений: ксенобиотиков (в том числе, полициклических ароматических углеводородов) и эндобиотиков (в том числе, стероидных гормонов) (Гордеева Л.Л., Глушков Л.П., Ермолина И.Л. и др. Сочетание материнских полиморфизмов CYP1A2*F и GST при врожденных пороках развития у плода и новорожденного. // Медицинская генетика, 2011, №11, с.9-15). Известно, что некоторые метаболиты таких соединений, как бензо[а]пирен (Bp), эстрадиол (Es) и прогестерон (Pg), обладают тератогенным эффектом. При делеции в гене GSTTl, приводящей к инактивации данного фермента детоксикации указанных метаболитов, вероятность возникновения ВПРП возрастает. Поэтому «нулевой» генотип GSTTl «0/0» считается неблагоприятным. При нормальном генотипе GSTTl «+» вероятность возникновения врожденных пороков развития плода снижаются. Поэтому генотип GSTTl «+» считается благоприятным для физиологического течения беременности.

К недостаткам данного способа следует отнести отсутствие информации об индивидуальных иммунологических реакциях организма на экзогенные и эндогенные тератогенные вещества. Между тем, известно, что антитела (Ig), специфичные к Bp, Es и Pg способны существенно модифицировать их биологические свойства (Ковалев И.П.., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным соединениям. // М.: Наука, 1985, 304 с.). Использование в данном способе только генетических маркеров детоксикации тератогенов без учета фенотипических иммунных реакций существенно снижает его точность и информативность по отношению к определению вероятности ВПРП.

Основной задачей предложенного изобретения является: разработка способа определения вероятности возникновения врожденных пороков развития плода у беременных женщин и повышение точности и информативности путем привлечения в систему лабораторных анализов иммунологических маркеров, в частности, антител, специфичных к тератогенным ксенобиотикам и стероидным гормонам.

Это достигается за счет того, что в предложенном способе определения вероятности возникновения ВПРП проводя определение путем молекулярно-генетического анализа полиморфизма гена фермента детоксикации GSTT1 в лимфоцитарной ДНК и путем иммуноферментного анализа антител классов A и G - IgA, IgG, специфичных к Bp, Hs и Pg n сыворотке крови, служащих показателями иммунной реакции организма на воздействие тератогенных факторов. При определении повышенных значений соотношений уровней антител IgA Bp/Fs>2, IgA Bp/Pg>2, IgG Bp/Hs>2 и IgG Bp/Pg>3 у носителей генотипа GSTTI «0/0» делают вывод о высокой индивидуальной чувствительности организма матери к действию тератогенных факторов и как следствие, о высокой вероятности возникновения ВПРП; при определении пониженных значений соотношений уровней антител IgA Bp/Hs≤2, IgA Bp/Pg≤2, IgG Bp/Fs≤2 и IgG Bp/Pg≤3 у носителей генотипа GSTTI «+» делают вывод о высокой индивидуальной устойчивости организма матери к действию тератогенных факторов и, следовательно, о низкой вероятности возникновения ВПРП.

Новизна данного подхода заключается в разработке комплекса генетических и иммунологических характеристик, оценка совокупности которых необходима для определения индивидуальной чувствительности организма матери к воздействию тератогенных ксено- и эндобиотиков, особенно в условиях проживания в экологически «неблагополучном» регионе, и более точного определения вероятности возникновения ВПРП.

Впервые установлены особенности образования антител к ксено- и эндобиотикам при ВПРП. Среди большого набора иммунологических и генетических показателей выделены маркеры, связанные с высокой вероятностью возникновения ВПРП: IgA Bp/Fs>2; IgA Bp/Pg>2; IgG Bp/Fs>2: IgG Bp/Pg>3 и GSTTI «0/0», а также маркеры, связанные с низкой вероятностью возникновения ВПРП: IgA Bp/Es≤2; IgA Bp/Pg≤2; IgG Bp/Hs≤2; IgG Bp/Pg≤3 и GSTTl «+».

Оценка совокупности уровней антител к ксено- и эндобиотикам и полиморфизма гена фермента детоксикации их тератогенных метаболитов позволила с большей точностью определять вероятность возникновения ВПРП, по сравнению с оценкой вероятности, рассчитанной только на основе анализа полиморфизма маркерного гена. Это может быть применено при прогнозировании состояния плода на ранних сроках беременности. В свою очередь выявленные особенности иммунохимических реакций на указанные соединения раскрывают дальнейшие перспективы для разработки новых методов иммунопрофилактики и иммунотерапии ВПРП.

Способ выполняется в следующей последовательности:

1. Формируют группы наблюдений па основе результатов иммуноферментного анализа антител к Bp, Es и Pg.

Формируют две группы доноров - с высокими и низкими значениями соотношения уровней антител. Для этого проводится анкетирование женщин: собирается гинекологический анамнез на основе медицинских карт. Все женщины подписывают информационное согласие на использование их биоматериала для научных исследований. Забор венозной крови производится натощак. В пластиковые пробирки типа «eppendorf» отделяют сыворотку объемом по 80 мкл и проводят иммуноферментный анализ. На полистироловые микро-планшеты адсорбируют конъюгаты бычьего сывороточного альбумина (BSA) с Bp, Es и Pg (Bp-BSA, Es-BSA, Pg-BSA) и в отдельные лунки только BSA. Инкубируют в течение ночи при +25°C. Планшет отмывают трижды промывочным раствором натрий-фосфатного буфера с добавлением Твин-20. Вносят сыворотку в разведении 1:20 (для IgA-антител), 1:100 (для IgG-антител) и инкубируют 1 час в термошейкере при +37°C с последующим отмыванием промывочным раствором 4 раза. Связывание антител выявляют с помощью конъюгатов антител кролика с пероксидазой хрена, специфичных к IgA и IgG человека. Уровень антител, специфичных к ксено- и эндобиотикам, определяют по формулам:

Ig-Bp=(OD_(Bp-BSA)-OD_(BSA)/OD_(BSA),

Ig-X=(OD_(X-BSA)-OD_(BSA))/OD_(BSA),

где OD - значение оптической плотности в соответствующих лунках, X эндобиотики Es и Pg.

Соотношение уровней антител ксенобиотик/эндобиотик рассчитывают по формуле:

Ig-Bp/X-(OD_(Bp-BSA)-OD_(BSA))/(OD_(BSA)-OD_(BSA))

При количественном преобладании у женщины значений соотношений IgA Bp/Hs и IgA Bp/Pg выше 2, IgG Bp/Es выше 2 и IgG Bp/Pg выше 3, донора относят в группу с высокими значениями соотношений уровней антител. В ином случае, при значениях соотношений IgA Bp/Es≤2, IgA Bp/Pg≤2, IgG Bp/Es≤2 и IgG Bp/Pg≤3 - в группу с низкими значениями соотношений уровней антител.

В нашем исследовании принимали участие 267 беременных женщин, находящихся во II триместре беременности (12-29 педели гестации). Соматический и гинекологический анамнез составлялся на основе медицинских карт. Обязательным критерием для включения женщин в исследования являлось прохождение ультразвукового обследования плода (скринингового на сроках 10-13 недель или 20-24 недели, а также по клиническим показаниям с 12 по 29 недели).

В среднем, соотношение уровней антител ксенобиотик/эндобиотик составило 1,3 для IgA Bp/Es; 1,5 для IgA Bp/Pg; 1,1 для IgG Bp/Es; 2,0 для IgG Bp/Pg. Однако, при учете данных УЗИ обнаружилось, что женщины, вынашивающие беременность с ВПРП, имели соотношения уровней антител ксено-/эндобиотик значимо выше, чем женщины, вынашивающие физиологическую беременность (ФВ). Полученные значения соотношений уровней антител представлены в таблице 1.

2. Формируют таблицу вероятности ВПРП на основе результатов иммуноферментного анализа антител к Bp, Hs и Pg.

Проводят сравнение частот высоких и низких значений соотношений антител у женщин с ФБ и ВПРП. Сравнение частот проводят по критерию χ² с поправкой Йетса с помощью ППП Statistica 6.0. При значении χ²<3,41 и p>0,05 разницу между группами считают не достоверной и все рассчитанные для них показатели - статистически не значимыми. Отношение шансов и доверительный интервал рассчитывают по формулам:

где: а - количество доноров с высоким значением данного соотношения уровней антител с диагнозом ВПРП;

b - количество доноров с низким значением данного соотношения уровней антител с диагнозом ВПРП;

c - количество доноров с высоким значением данного соотношения уровней антител с ФБ;

d - количество доноров с низким значением данного соотношения уровней антител с ФБ.

Для построения доверительного интервала CI берут величину L=InOP, которую приближенно можно считать нормально распределенной со средним значением:

или

и стандартным отклонением:

Нижней и верхней доверительными границами показателя, между которыми его показатели находятся с вероятностью 1-α, соответственно составляют величины:

,

где t∞(α) - значение критерия Стьюдента, соответствующее вероятности ошибки α.

В качестве нижней и верхней доверительных границ берут антилогарифмы от величин и :

где е=2,718

Если доверительный интервал не включает значения 1,0, то связь фактор-заболевание считают статистически значимой.

Вероятности возникновения ВПРП для разных значений соотношений уровней антител приведены в таблице 2. При значениях вероятности выше 1,5 делают вывод о предрасположенности к возникновению ВПРП, при значениях ниже 0,7 об устойчивости к формированию ВПРП.

Видно, что при высоких значениях соотношений уровней lg-Bp/Hs и Bp/Pg вероятность возникновения ВПРП составляют 2,5-6,8. При низких значениях соотношений уровней Ig-Bp/Hs и Bp/Pg вероятность возникновения ВПРП<0,5.

3. Определяют генетическую предрасположенность к ВПРП на основе молекулярно-генетического анализа GSTTJ.

Проводят генотипирование женщин. Выделение ДНК из лимфоцитов крови проводится с помощью метода фенол-хлороформной экстракции с последующим осаждением этанолом (Sambrook J., Fritsch В., Maniatis Т., 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed. (v. 1-3)).

Используемые тест-системы для молекулярно-генетического анализа полиморфизма GSTT1 разработаны в ИХБФМ СО РАН (г.Новосибирск).

Типирование гена GSTTl проводится методом мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени. Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР выбираются внутри области делеции в гене GSTTl и связаны с отсутствием синтеза соответствующего продукта ПЦР при анализе образцов ДНК с генотипом GSTT1 «0/0». Для того, чтобы отличить наличие гомозиготной делеции в гене GSTTl от отсутствия ДНК матрицы или ингибирования реакции ПЦР, в амплификационную смесь вводится внутренний контроль, в качестве которого используется некодирующий фрагмент генома с низкой температурой плавления, условно обозначаемый как LTM (low temperature melting). Структура праймеров для LTM детально описана в работе Kostrykina N.A. (Kostrykina N.A., Pechkovskii E.V., Mishukova O.V. et al. Studying the association of polymorphic variants of GSTMl and GSTTI genes with breast cancer in female residents of Altai Krai.// Bull. Exp.Biol. Med. - 2009. - Vol.148, №1. - P.89-93). Размеры амплифицируемых фрагментов: GSTTI - 287 пар оснований, LTM - 127 пар оснований, расчетная температура отжига всех праймеров составляет 64-66°C, ожидаемая температура плавления продуктов амплификации - GSTT1 -92,5°C, 17М-78,5°C.

Амплификация проводится с помощью амплификатора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США). ПЦР проводится при следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 95°C, 38 циклов в режиме: денатурация 10 с при 95°C, отжиг праймеров 10 с при 64°C, элонгация 14 с при 72°C. Результаты интерпретируются исходя из анализа графиков накопления флуоресценции. Отсутствие флуоресцентного сигнала указывает на гомозиготность индивидуума по делеции гена («0»). Гетерозиготы по мутации (генотип «+/0») рассматриваются в одной группе с носителями нормальных генов («+»).

Следствием делеции в гене GSTTl является отсутствие функциональной активности этого фермента инактивации гено- токсических метаболитов низкомолекулярных органических соединений. (Hayes J.D., Flanagan J.U., Jowscy I.R. Glutathione transferases.// Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2005. - Vol.45. - P.51-88).

4. Формируют таблицу вероятности ВПРП на основе результатов молекулярно-генетического анализа.

Проводят сравнение частот генотипов у женщин с ФБ и с ВПРП. Отношение шансов рассчитывают по формулам:

где: а - количество доноров-носителей делеционного генотипа GSTTl «0/0» с диагнозом ВПРП;

b - количество доноров-носителей нормального генотипа GSTTl «+» с диагнозом ВПРП;

с - количество доноров-носителей делеционного генотипа GSTTl «0/0» с ФБ;

d - количество доноров-носителей нормального генотипа GSTTl «+» с ФБ.

Доверительный интервал (С1) выстраивают так же, как описано в пункте 2. Значения вероятности возникновения ВПРП для разных сочетаний генотипов приведены в таблице 3. При наличии делеции в гене GSTTl (0/0) вероятность возникновения ВПРП возрастают в 2,1 раза. При наличии GSTTl «+» вероятность возникновения ВПРП снижаются до 0,5.

5. Формируют таблицу вероятности возникновения ВПРП на основе результатов иммуноферментного анализа антител к Bp, Es и Pg в комплексе с молекулярно-генетическим анализом полиморфизма GSTTl.

Проводят сравнение частот сочетаний генотипа GSTTl «0/0» с высокими значениями соотношений уровней антител у женщин с ФБ и ВПРП. Отношение шансов рассчитывают по формулам:

где: a - количество доноров-носителей делеционного генотипа GSTT1 «0/0» с высоким значением соотношения уровней антител с диагнозом ВПРП;

b - количество остальных доноров из выборки с диагнозом ВПРП; с - количество доноров-носителей делеционного генотипа GSTTl «0/0»

с - высоким значением соотношения уровней антител с ФБ;

d - количество остальных доноров из выборки с ФБ.

Проводят сравнение частот сочетаний генотипа GSTTl «+» с низкими значениями соотношении уровней антител у женщин с ФБ и ВПРП. Отношение шансов рассчитывают по формулам:

где: a - количество доноров-носителей нормального генотипа GSTTl «+» с низкими значением соотношения уровней антител с диагнозом ВПРП;

b - количество остальных доноров из выборки с диагнозом ВПРП;

с - количество доноров-носителей нормального генотипа GSTTl «+» с низким значением соотношения уровней антител с ФБ;

d - количество остальных доноров из выборки с ФБ.

Доверительные интервалы (C1) выстраивают так же, как описано в пункте 2. Результаты представлены в таблице 4. Видно, что у гомозигот по делеции GSTTl «0/0» при высоких значениях соотношений IgA Bp/Es>2, IgA Bp/Pg>2, IgG Bp/Es>2, IgG Bp/Pg>3 значения OR значительно выше, чем при анализе только антител без учета генетического полиморфизма GSTT1 (табл.2); значения и OR значительно выше, чем при анализе только генетического полиморфизма GSTTl без учета уровней антител (табл.3). У носителей нормального генотипа GSTTl «+» при низких значениях соотношений IgA Bp/Es<2, IgA Bp/Pg<2, IgG Bp/Es<2, IgG Bp/Pg<3 значения χ² выше, а значения OR ниже, чем при анализе только генетического полиморфизма GSTTl без учета уровней антител. Это подтверждает, что предлагаемый способ определения вероятности возникновения ВПРП у беременных женщин с помощью иммуноферментного анализа антител к Bp, Es и Pg в комплексе с молекулярно-генетическим анализом полиморфизма GSTTl по сравнению с известным методом с помощью только одного анализа генетического полиморфизма GSTTl отличается более высокой точностью и информативностью.

6. Детальное описание способа.

Пример 1.

У обследуемой Т., 25 лет, первая беременность, на сроке 12 недель в стеклянную пробирку была взята кровь из локтевой вены в объеме 3 мл. 80 мкл плазмы были отобраны для дальнейшего проведения иммуноферментного анализа. Полистироловые планшеты инкубировались ночь при +25°С с конъюгатами Bp-, Es- и Pg-BSA и отдельно с BSA. Сыворотку разводили в белковом растворе с добавлением 0,5% Twin-20. Связывание антител выявляли с помощью конъюгатов антител кролика, специфичных к иммуноглобулинам человека. Показания оптической плотности снимали на фотометре «Пикон» (Россия). Образец ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови методом фенол-хлороформной экстракции с последующем осаждением этанолом. Типирование гена GSTTl проводили методом мультиплексной ПЦР. Амплификацию проводили с использованием амплификатора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США). Обнаруженные генетические полиморфизмы и значения соотношений антител представлены в таблице 5. Выявлено наличие высоких значений соотношений уровней антител в сочетании с делецией в гене GSTT1. Па этом основании сделано заключение о наличии высокой вероятности возникновения ВПРП, что подтвердилось после прохождения пациенткой ультразвукового обследования плода на сроке 23 недель гестации. По результатам УЗИ был поставлен диагноз: врожденный порок развития костно-мышечного аппарата укорочение левого предплечья и кисти.

Пример 2.

У первобеременной Н., 28 лет, на сроке 19 недель гестации в стеклянную пробирку была взята кровь из локтевой вены в объеме 3 мл. Антитела определялись описанным методом ИФА. Лейкоцитарную ДНК выделяли с использованием фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование GSTTl проводилось описанным методом ПЦР. Результаты обследования представлены в таблице 6. По результатам иммуноферментного анализа выявлены высокие значения соотношений уровней антител. Кроме того, выявлена делеция в гене GSTTl. На этом основании сделан вывод о наличии высокой вероятности возникновения ВПРП. Это подтвердилось результатами УЗИ на сроке 24 недель. Был поставлен диагноз: врожденный порок развития мочевыделительной системы - аплазия правой почки.

Пример 3.

У первобеременной Л., 25 лет, на сроке 15 недель гестации была взята кровь из локтевой вены в объеме 3 мл. Антитела определялись описанным методом ИФЛ. Лейкоцитарную ДНК выделяли с использованием фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование GSTTl проводилось описанным методом ПЦР. Результаты обследования представлены в таблице 7. Выявлены пониженные значения соотношений антител, а также отсутствие делеции в гене GSTT1. Сделан вывод о снижении вероятности возникновения ВПРП. По данным УЗИ на сроках 22 и 31 недели каких-либо патологий плода выявлено не было.

Медианы соотношений уровней антител ксенобиотик/эндобиотик у женщин с врожденными пороками развития плода (ВПРП) и с физиологической беременностью (ФБ). Достоверность различий (р) рассчитана с помощью непараметрического критерия Mann-Whitney

Вероятность возникновения ВПРП на основе результатов иммуноферментного анализа антител к Bp, Es и Pg