СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА К ВОЗДЕЙСТВИЮ ПОВЫШЕННЫХ ДОЗ ИЗЛУЧЕНИЙ РАДОНА И ПРОДУКТОВ ЕГО РАСПАДА

Изобретение относится к области медицины, генетики человека и может быть использовано для оценки индивидуальной радиочувствительности генома человека (в случаях проживания или работы в условиях воздействия повышенных доз радона).

Известны способы биологической индикации радиационных воздействий, позволяющие подтверждать факт облученности и степень ее тяжести, основанные на определении в лимфоцитах периферической крови обследуемого хромосомных аберраций (ХА) дицентрического типа и Е-37-розеткообразующих лимфоцитов (патент RU 2126156 C1, кл. G01N 33/53, опубл. 10.02.1999).

Известен также способ экспресс-выявления облученных пациентов с повышенными частотами ХА (патент RU 2141658 С1, кл. G01N 33/48, опубл. 20.11.1999). В качестве маркера для выявления пациентов с повышенными частотами ХА после радиационных воздействий используют аномалии ядер интерфазных лимфоцитов типа «хвостов» в мазках крови. По повышенной частоте встречаемости таких лимфоцитов (0,8% и выше) выявляют пациентов с повышенной частотой ХА. К недостаткам данного способа следует отнести отсутствие прогностической значимости, т.к. в данном способе речь идет не о риске накопления хромосомных нарушений, не об определении индивидуальной чувствительности генома до радиационного воздействия, а только об индикации - выявлении лиц с повышенными уровнями хромосомных мутаций после радиационного воздействия. Это существенно сужает область применения и информативность способа.

Наиболее близким способом оценки индивидуальной радиочувствительности может служить способ определения индивидуальной чувствительности генома человека к воздействию радона в бытовых или производственных условиях по комплексу генетических маркеров (патент RU 2415427 С1, кл. G01N 33/48, опубл. 27.03.2011). Суть метода заключается в том, что у испытуемого из клеток крови выделяют ДНК и определяют предрасполагающие и протективные генотипы генов-кандидатов: маркер Arg280His гена XRCC1 - предрасполагающий генотип Arg/Arg, протективный генотип Arg/His; маркер Argl94Trp гена XRCC1 - предрасполагающий генотип Arg/Arg, протективный генотип Arg/Tip; маркер Asnl48Glu гена АРЕ1 - предрасполагающий генотип Glu/Glu, протективные генотипы Asn/Asn, Asn/Glu; маркер A2455G гена CYP1A1 - предрасполагающий генотип A/G, протективные генотипы А/А и G/G; маркер делеция в гене GSTM1 - предрасполагающий генотип о/о, протективный +, и делают заключение о высокой индивидуальной чувствительности к действию повышенных доз радона при количественном преобладании предрасполагающих генотипов или равном количестве предрасполагающих и протективных генотипов, а о высокой индивидуальной устойчивости к воздействию радона - при количественном преобладании протективных генотипов.

К недостаткам данного способа следует отнести инвазивность метода (необходимо забирать кровь из локтевой вены). Кроме того, спектр генов, полиморфизмы которых использовались в данном способе, недостаточно широк и не включает многие важные системы ферментов, участвующих в репарации двунитевых разрывов ДНК. Это существенно сужает информативность способа.

Основной задачей предложенного изобретения является разработка способа оценки индивидуальной чувствительности генома человека к воздействию сверхнормативных доз излучений радона и продуктов его распада путем использования неинвазивных методов определения генотоксических эффектов и генетического полиморфизма, а также повышение прогностической значимости путем привлечения в систему прогноза дополнительных молекулярно-генетических маркеров (генов ферментов репарации ДНК).

Поставленная задача решается в предложенном способе оценки индивидуальной чувствительности генома человека к воздействию повышенных доз излучений радона и продуктов его распада, включающем прогнозирование уровня микроядер и протрузий в буккальных эпителиоцитах путем определения предрасполагающих и протективных генотипов генов-кандидатов: маркер Arg399Gln гена XRCC1 - предрасполагающий генотип Arg/Gln, протективный генотип Arg/Arg; маркер Argl94Trp гена XRCC1 - предрасполагающий генотип Arg/Trp; маркер Glul85Gln гена NBS1 - предрасполагающий генотип Glu/Gln, протективный генотип Glu/Glu; маркер Ser326Cys гена hOGG1 - предрасполагающий генотип Ser/Cys; маркер Aspl853Asn гена ATM - предрасполагающий генотип Asp/Asp, протективный генотип Asp/Asn; маркер Asp1104His гена XPG - протективный генотип His/His и делают заключение о высокой индивидуальной чувствительности к действию повышенных доз радона при количественном преобладании предрасполагающих генотипов или равном количестве предрасполагающих и протективных генотипов и о прогнозировании накопления микроядер и протрузий, а о высокой индивидуальной устойчивости к воздействию радона - при количественном преобладании протективных генотипов и о прогнозировании устойчивости к накоплению микроядер и протрузий.

При этом оценку индивидуальной чувствительности генома человека проводят при воздействии радона и продуктов его распада в дозах свыше 200 Бк/м³.

Развитие неинвазивных методов стало в последние годы важным направлением работы в цитогенетике человека. Разработаны нетравмирующие методы оценки уровня генетических нарушений. К ним в первую очередь относится метод учета микроядер (МЯ) в клетках буккального эпителия. МЯ может быть образовано фрагментом хромосомы в результате повреждения ДНК либо, в случае повреждения веретена деления, представлено одной или более целыми хромосомами, отставшими в анафазе и не вошедшими в основное ядро. Большое значение имеет также учет протрузий (Пр) типа «язык», «пузырек», «разбитое яйцо», которые возникают в результате различных нарушений генетического аппарата клетки [Сычева Л.П. Биологическое значение, критерии определения и пределы варьирования полного спектра кариологических показателей при оценке цитогенетического статуса человека // Медицинская генетика. - 2007. - 6 (11). - С.3-11]. Микроядерный тест на клетках буккального эпителия оказался высокоинформативным при тестировании генотоксических эффектов лучевой терапии [Tolbert Р.Е., Shy С.М., Allen J.W. Micronuclei and other nuclear anomalies in buccal smears: methods development // Mut. Res. - 1992. - Vol.271. - P.69-77]. Однако практически ничего не известно о накоплении микроядер в эпителии при воздействии радона.

Нами было экспериментально установлено, что суммарная частота МЯ и Пр в эпителиоцитах детей, подвергающихся воздействию повышенных доз радона, значимо превышает фоновый региональный уровень. Это свидетельствует о выраженной генотоксичности действия повышенных доз радона на эпителий дыхательных путей. Также нами было показано, что существует широкая вариабельность индивидуальной чувствительности к действию радона (от полного отсутствия Мя и Пр до 25‰). Это может быть обусловлено генетической предрасположенностью.

В качестве маркеров предрасположенности были выбраны гены ферментов репарации ДНК, т.к. именно они отвечают за эффективность восстановления поврежденного генома. Среди широкого спектра данных полиморфных генов нами были найдены те, которые статистически значимо были связаны с индивидуальной повышенной или пониженной чувствительностью к действию высоких доз радона. Это оказались маркеры генов ферментов репарации двунитевых разрывов ДНК (NBS и ATM), эксцизионной репарации нуклеотидов (XPG) и эксцизионной репарации оснований (XRCC1). На основании полученных данных нами был разработан комплекс генетических характеристик, оценка совокупности которых необходима и достаточна для прогноза формирования у человека повышенного уровня клеток с микроядрами и протрузиями, т.е. для прогноза повышенной индивидуальной чувствительности к действию высоких доз радона.

Способ выполняют в следующей последовательности.

1. Формируют группы наблюдений. Для этого формируют две группы доноров с высоким (выше среднего) и низким уровнем МЯ и Пр, образующихся в условиях хронического высокого воздействия радона. В нашей работе были обследованы дети-подростки (318 человек), проживающие в школе-интернате. Было экспериментально установлено, что концентрация радона в воздухе помещений школы-интерната превышает допустимый уровень для эксплуатируемых зданий (до 200 Бк/м³) и составляет, в среднем, 334 Бк/м³ в весенний период и 583 Бк/м³ в зимний период (достигая в отдельных помещениях первого этажа 1000 Бк/м³).

Выбор детей-подростков обоснован тем, что в этом случае минимизируется воздействие таких факторов, как вредные привычки, хронические болезни, исключается влияние профессионального контакта с производственными вредностями. Помимо этого, компактное нахождение всех членов выборки (совместное проживание в школе-интернате не менее 3 месяцев до начала исследования) обеспечивает максимальную унификацию по параметрам питания и условиям проживания. Все доноры не имели хронических заболеваний, были некурящие. В обследование не включали детей, получающих медикаментозное лечение, а также проходивших рентгенологическое обследование в течение 3 мес до сбора материала. На каждого обследуемого был оформлен протокол информированного согласия, подписанный родителями либо лицами, осуществляющими опеку несовершеннолетних. Половозрастная характеристика групп представлена в таблице 1.

Приготовление препаратов буккального эпителия и идентификацию кариологических показателей осуществляли в соответствии с рекомендациями N.Holland [Holland N., Bolognesi С, Kirsch-Volders M., et al. The micronucleus assay in human buccal cells as a tool for biomonitoring DNA damage: The HUMN project perspective on current status andknowledge gaps // Mutat. Res. - 2008. - 659. - P.93-108] и Tolbert [Tolbert P.E., Shy С.М., Allen J.W. Micronuclei and other nuclear anomalies in buccal smears: methods development // Mut. Res. 1992. - 271: P.69-77]. Перед взятием образцов буккального эпителия дети тщательно ополаскивали рот очищенной питьевой водой. Затем смоченным в буферном растворе (Tris НСl, EDTA, NaCl, рН 7) шпателем проводили несколько раз с внутренней стороны щеки, после чего шпатель ополаскивали в буферном растворе. Процедуру повторяли 4-5 раз с каждой стороны щеки до помутнения раствора. Клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин, надосадок отсасывали, осадок аспирировали и буферным раствором доводили объем до 10 мл. Промывку проводили 3 раза. После третьей промывки осадок объемом 1 мл раскапывали на предварительно отмытые и подогретые предметные стекла, используя покачивания из стороны в сторону для равномерного распределения клеток по стеклу. Высушенные на воздухе препараты фиксировали фиксатором Кларка в течение 15 мин, окрашивали 2.5% раствором ацетоорсеина при 37°C в течение 1 ч. Докрашивание цитоплазмы клеток проводили 1% спиртовым раствором светлого зеленого в течение 1-2 мин. Анализ препаратов проводили на микроскопе Nikon Е200 при увеличении 40×1.5×10 и 100×1.5×10.

На каждом препарате анализировали 1000 клеток. МЯ идентифицировали как хроматиновые округлые тела округлой или овальной формы с гладким непрерывным краем, размером не более 1/3 ядра, лежащие четко отдельно от основного ядра, не преломляющие свет, имеющие интенсивность окрашивания и рисунок хроматина, как у основного ядра, и находящиеся в одной плоскости с ядром [Tolbert P.Е., Shy С.М., Allen J.W. 1992. Micronuclei and other nuclear anomalies in buccal smears: methods development. Mut. Res. 271: 69-77. Tolbert et al., 1992]. Параллельно с учетом МЯ проводилась регистрация ядерных протрузий типа «пузырек», «язык», «разбитое яйцо», а также таких аномалий, как двуядерность, сдвоенные ядра, ядра с перинуклеарными и ядерными вакуолями, конденсированный хроматин, пикноз, кариорексис, кариолизис, ядра атипичной формы и клетки с апоптозными телами [Юрченко В.В., Кривцова Е.К., Подольная М.А. и др. Использование микроядерного теста на эпителии слизистой оболочки щеки человека // Гиг. Санит. - 2008. - 6. - с.53-56]. Частоту клеток с МЯ, протрузиями ядра, ядром атипичной формы, с двумя ядрами, с круговой насечкой, перинуклеарными и ядерными вакуолями выражали в промилле (‰).

Выделение ДНК из буккального эпителия проводили следующим образом:

1. Для лизирования клеток в суспензию эпителиоцитов добавляли 125 мкл лизирующего буфера (0,1 М Tris-HCl, 0,1 М EDTA, 0,01 М NaCl, 1% SDS, рН 8,0) и осторожно перемешивали до полного смешивания (переворачивали).

2. Лизат подвергали действию протеиназы К (5 мкл - 10 мг/мл). Ставили в термостат на 2 часа при температуре 55°C либо на ночь при температуре 37°C.

3. Добавляли 125 мкл 4М NaCl и раствор перемешивали на вортексе.

4. Охлаждали раствор на льду 5-10 минут.

5. Центрифугировали при 12000 об/мин 15 мин. Охлаждали на льду 2 мин.

6. Если супернатант не чистый, то его переносили в новую пробирку и центрифугировали еще 15 мин.

7. Супернатант, содержащий ДНК, переносили в другую пробирку, добавляли 5 мкл ЛПААГ и равный объем изопропанола.

8. Центрифугировали раствор при 12000 об/мин 15 мин.

9. ДНК промывали 70% этанолом и высушивали при температуре 37°C в течение 15 мин.

10. Высушенную ДНК растворяли в 100 мкл ТЕ буфера (10 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, рН 8,0) на шейкере при 68°C 30 мин.

11. Хранили ДНК при -20°C.

Примечание: протеиназу К растворяли в 20 mM CH₃COONa. В конечном растворе ее должно быть 150 мкг/мл.

Для генотипирования полиморфных маркеров Arg399Gln и Argl94Trp гена XRCC1, Glul85Gln гена NBS1, Ser326Cys гена hOGG1, Aspl853Asn гена ATM, Asp1104His гена XPG использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и набор реактивов, разработанный НПФ «Литех» (г. Москва). Амплификацию проводили с использованием амплификатора «Терцик». Электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов проводили в 3% агарозе с последующей окраской бромистым этидием.

В среднем, суммарная частота МЯ и Пр у обследованных доноров всей выборки составила 4,7±0,2‰, что достоверно значимо превышает значения фонового уровня для региона (2,9±0,3‰). Это подтверждает факт генотоксического воздействия радона. Примечательным является то, что, несмотря на сходство воздействующих факторов: интенсивность воздействия радона, возраст, питание, состояние здоровья, 55% детей демонстрируют особенно высокие показатели МЯ и Пр. У 142 человек частота клеток с МЯ и Пр была выше среднего и составила, в среднем, 7,7±0,3‰. Очевидно, что причины подобной повышенной чувствительности генетически детерминированы. Из этих доноров и была сформирована опытная группа. В группу сравнения вошли 176 человек. Средняя частота клеток с МЯ и Пр в данной группе была ниже среднего и составила 2,2±0,1‰. Разница между этими группами была статистически достоверна (р<0,0001).

2. Формируют таблицу относительного риска.

Для статистически значимо отличающихся по критерию χ² вариантов рассчитывают относительный риск и доверительный интервал по формуле:

где pD - частота встречаемости доноров с повышенным уровнем МЯ и Пр, OR - отношение шансов, которое рассчитывается по формуле:

где а+0,5 - количество носителей данного гена/генотипа с высоким уровнем МЯ и Пр; b+0,5 - количество носителей данного гена/генотипа с невысоким уровнем МЯ и Пр; с+0,5 - количество доноров с высоким уровнем МЯ и Пр без данного гена/генотипа; d+0,5 - количество доноров с низким уровнем МЯ и Пр без данного гена/генотипа (с поправкой на малое число наблюдений).

Для построения доверительного интервала берут величину L=lnOR, которую приближенно можно считать нормально распределенной со средним значением:

и стандартным отклонением:

Нижней и верхней доверительными границами показателя, между которыми его показатели находятся с вероятностью 1-α, соответственно являются величины:

где t∞(α) - значение критерия Стьюдента, соответствующее вероятности ошибки а; в частности, при построении 95% доверительного интервала α=0,05 и t∞(α)=1,96; при 99% доверительного интервала α=0,01 и t∞(α)=2,58; а при 99,9% доверительного интервала α=0,001 и t∞(α)=3,29.

В качестве нижней и верхней доверительных границ берут антилогарифмы от величин и :

где е=2,718.

Значения относительного риска для всех причинных генотипов приведены в таблице 2. При относительном риске более 1 делают заключение о предрасположенности, при относительном риске менее 0 - о генетической устойчивости от формирования высокого уровня МЯ и Пр.

3. Формируют таблицу протективных и предрасполагающих генотипов (табл.3).

4. Детальное описание способа.

Пример 1.

У обследуемой Т. 13 лет, проживающей в школе-интернате с повышенным уровнем радона внутри помещений, в среднем, 334 Бк/м³, был взят для анализа буккальный эпителий. Для этого смоченным в буферном растворе шпателем проводили несколько раз с внутренней стороны щеки, после чего шпатель ополаскивали в буферном растворе. Далее данный раствор, представляющий собой суспензию клеток, использовали для приготовления препаратов буккального эпителия и выделения ДНК.

Проводили процедуру подготовки и анализа препаратов буккальных эпителиоцитов. В результате проведенного кариологического анализа эпителия МЯ и ПР у обследованной Т. выявлено не было.

С использованием метода полимеразной цепной реакции и набора реактивов, разработанного НПФ «Литех» (г. Москва), проводили генотипирование нуклеотидных замен Arg399Gln и Argl94Trp гена XRCC1, Glu185Gln гена NBS1, Ser326Cys гена hOGG1, Asp1853Asn гена ATM, Asp1104His гена XPG. Полученные значения генотипов и аллелей представлены в таблице 4. Установлено наличие 1 предрасполагающего и 3 - протективных генотипов. Сделано заключение о генетически детерминированной устойчивости к формированию Мя и Пр в условиях воздействия радона. Это заключение подтвердилось тем, что при анализе эпителиоцитов обследуемой Т. МЯ и Пр выявлено не было.

Пример 2.

У обследуемого Т. 10 лет, проживающего в школе-интернате с уровнем радона внутри помещений, в среднем, 583 Бк/м³ на момент анализа, проводили типирование кариологических показателей и полиморфных маркеров генов. Процедуры выполняли так же, как описано в примере 1. Уровень Мя и Пр составил 4‰. Результаты генотипирования представлены в таблице 5. Выявлено преобладание предрасполагающих генотипов (4 предрасполагающих генотипа и 1 - протективный). Исходя из полученных результатов сделано заключение о существовании высокого риска генетически детерминированных МЯ и Пр при воздействии радона. Это заключение согласуется с результатами кариологического анализа, показавшего высокий уровень МЯ и Пр.

5. Эффективность способа.

Определяли полиморфные гены-кандидаты в группе сравнения у подростков, подвергающихся хроническому воздействию радона. Обнаружили, что из 176 человек с относительно небольшим уровнем МЯ и Пр (2,2±0,1‰) у 45 подростков имело место преобладание предрасполагающих генотипов или равное количество предрасполагающих и протективных генотипов. Это свидетельствует о том, что их индивидуальная чувствительность к воздействию радона повышена.

Мя и Пр у них оказалось больше (2,5±0,2‰), чем у других 131 из 176 подростков с преобладанием протективных генотипов и обладающих индивидуальной устойчивостью к действию радона (2,0±0,1‰, р<0,05). Очевидно, что с увеличением времени воздействия радона уровень Мя и Пр у 131 подростка с генетически детерминированной индивидуальной устойчивостью будет возрастать в меньшей степени, чем у 45 подростков с генетически детерминированной индивидуальной чувствительностью. Таким образом, группа с повышенной чувствительностью к действию радона (142 человека), сформированная с помощью известного метода анализа микроядер в буккальных эпителиоцитах, увеличилась на 45 человек за счет применения предлагаемого способа, включающего в себя определение полиморфных генов-кандидатов. То есть эффективность способа повысилась на 31,7%.

6. Вывод.

Оценка совокупности полиморфизмов генов ферментов репарации ДНК, использованная в предложенном способе, позволила с высокой эффективностью и точностью определять потенциальный риск формирования МЯ и Пр у лиц, подвергающихся воздействию природной радиации. Это может быть использовано для оценки индивидуальной чувствительности к действию радона как внутри жилых помещений, так и в промышленных условиях, например у шахтеров, работающих в условиях воздействия очень высоких доз радона. Предложенный способ обладает большей прогностической значимостью, т.к. позволяет проводить оценку генетически детерминированной предрасположенности к формированию повышенного уровня микроядер и протрузий еще до воздействия радиационного фактора.