СПОСОБ УСКОРЕННОГО ВЫРАЩИВАНИЯ ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ, СВЯЗАННЫХ С ОКАЗАНИЕМ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и касается способа ускоренного выращивания золотистого стафилококка (Staphilococcus aureus) для применения в диагностике инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. Известен стандартный способ выращивания стафилококка для диагностики инфекций, вызванных этими микроорганизмами, заключающийся в использовании в качестве питательной среды желточно-солевого агара. При этом длительность выращивания по стандартной методике [2,6,7] составляет до 48 часов.

Нерациональное использование антимикробных препаратов привело к развитию резистентности к ним многих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (в том числе стафилококков) и широкому распространению социально значимых стафилококковых инфекций, принимающих угрожающий характер и являющихся причиной развития внутрибольничных гнойно-воспалительных заболеваний, особенно в хирургических отделениях, родильных домах, педиатрических стационарах (язвенные энтероколиты, энтериты, перитониты, эндокардиты, пневмонии, абсцессы легкого, стафилококковый сепсис и др.) [1,8,9]. Длительность существующего производства бактериологических анализов негативно сказывается на оказании своевременной медицинской помощи пациенту, усложняя быстрое применение адекватной терапии. Поэтому является актуальной разработка способов ускоренного выращивания стафилококков для диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.

Целью изобретения является повышение скорости роста золотистого стафилококка для диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, и сокращение времени выдачи результата анализа для своевременного назначения адекватной антибиотикотерапии.

Поставленная цель достигается тем, что при выращивании золотистого стафилококка для целей диагностики на стадии подготовки к выполнению анализа в питательную среду на основе желточно-солевого агара в качестве стимулятора роста микроорганизмов вводят химические соединения: трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенилсульфанилацетат (1) или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенилсульфонилацетат (2) или трис(2-гидрокси-этил)аммоний 2-хлорфенилоксиацетат (3) или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метил-4- хлорфенилоксиацетат (4) или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 1-бензилиндол-3-ил-сульфонилацетат (5) в виде водных растворов в концентрации 10^-4-10^-6 вес.% (табл.1). При использовании стимуляторов роста 1-5 время роста стафилококка сокращается с 48 (без применения стимуляторов) до 9 часов.

В таблице 1 представлена химическая структура стимуляторов 1-5.

В таблице 2 представлено влияние биостимуляторов 1-5 на рост Staphylococcus aureus.

В качестве стимуляторов роста 24 штаммов St. aureus, выделенных от больных с гнойно-септическими осложнениями из отделения хирургического профиля, впервые исследованы биологически активные соединения - представители нового класса биологически активных протонных (2-гидроксиэтил)аммониевых ионных жидкостей [3-5].

Способы получения и свойства стимуляторов 1-5 приведены в примерах 1-5. Состав и строение соединений 1-5 подтверждали методами ИК, ЯМР-спектроскопии и элементного анализа. ИК спектры (v, см^-1) записывали на спектрофотометре Varian 3100 FT-IR75 в КВr. Спектры ЯМР (δ, м.д.) снимали в D₂O на спектрометре DPX 400 (400,13 МГц для ¹Н и 101,62 МГц для ¹³С).

Следующие примеры иллюстрируют изобретение:

Пример 1. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенилсульфанилацетат (1)

К раствору 2.03 г (0.01 моль) 4-хлорфенилсульфанилуксусной кислоты в 10 мл этанола прикапывали этанольный раствор 1.49 г (0.01 моль) трис-(2-гидроксиэтил)амина (10 мл). Смесь перемешивали при 25°С 3 часа. Растворитель отгоняли в вакууме. Твердый остаток многократно промывали эфиром и высушивали в вакуумном эксикаторе над Р₂О₅. Получали бесцветный порошок (выход 3.44 г, 98%) с т.пл. 91°С, хорошо растворимый в воде и органических растворителях (ацетон, ТГФ, спирты). ЯМР¹H: 7.11-6.32 (м, 4Н, C₆H₄S), 3.75 (т,6Н, ОСН₂), 3.44 (с, 2Н, SCH₂COO), 3.28 (т, 6Н, NCH₂). ЯМР,¹³С: 177.19 (С=O), 155.81-111.55 (C₆H₄S), 60.79(SCH₂COO), 55.09(ОСН₂), 54.83(NCH₂). ИК: 1560 (С=O), 2550-2700 (H⁺N), 3300 (ОН). Найдено, %: С, 48.11; Н, 6.01; N, 3.93. C₁₄H₂₂ClNO₅S. Вычислено, %: С, 47.79; Н, 6.30; N, 3.98.

Пример 2. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенилсульфонилацетат (2)

Получали из 4-хлорфенилсульфонилуксусной кислоты и трис-(2-гидроксиэтил)амина аналогично 1. Бесцветный порошок с т.пл. 93°С. Выход 97%. ЯМР¹Н: 7.19-6.22 (м, 4Н, C₆H₄SO₂), 4.04 (с, 2Н, SO₂CH₂COO), 3.71 (т,6Н, ОСН₂), 3.22 (т, 6Н, NCH₂). ИК: 1566 (С=O), 2500-2710 (H⁺N), 3310(ОН). Найдено, %: С, 44.10; Н, 5.50; N, 3.63. C₁₄H₂₂ClNO₇S. Вычислено, %: С, 43.80; Н, 5.77; N, 3.65.

Пример 3. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-хлорфенилоксиацетат (3)

Получали из 2-хлорфенилоксиуксусной кислоты и трис-(2-гидроксиэтил)амина аналогично 1. Бесцветный порошок с т.пл. 81-83°С. Выход 99%. ЯМР¹Н: 7.26-6.02 (м, 4Н, С₆Н₄), 4.24 (с, 2Н, ОСН₂СОО), 3.70 (т,6Н, ОСН₂), 3.22 (т, 6Н, NCH₂). ЯМР¹³С: 178.09 (С=O), 157.01-111.05 (С₆Н₄O), 60.00(ОСН₂СОО), 57.19(ОСН₂), 55.93(NCH₂). ИК: 1558 (С=O), 2520-2700 (H⁺N), 3330(ОН). Найдено, %: С, 50.23; Н, 6.50; N, 4.18. C₁₄H₂₂ClNO₆. Вычислено, %: С, 50.07; Н, 6.60; N, 4.17.

Пример 4. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метил-4-хлор-фенилоксиацетат (4)

Получали из 2-метил-4-хлор-фенилоксиуксусной кислоты и трис-(2-гидроксиэтил)амина аналогично 1. Бесцветный порошок с т.пл. 88°С Выход 98%. ЯМР¹Н: 7.72-6.22 (м, 3Н, С₆Н₃), 4.44 (с, 2Н, ОСН₂СОО), 3.78 (т,6Н, ОСН₂), 3.38 (т, 6Н, NCH₂), 2.25 (СН₃). ЯМР¹³С: 175.19 (С=O), 156.21-111.11 (С₆Н₃O), 62.23(ОСН₂СОО), 58.29(ОСН₂), 57.93(NCH₂), 14.71 (СН₃). ИК: 1563 (С=O), 2500-2720 (H⁺N), 3310(ОН). Найдено, %: С, 51.72; Н, 6.62; N, 4.04. C₁₅H₂₄ClNO₆. Вычислено, %: С, 51.50; Н, 6.91; N, 4.00.

Пример 5. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 1-бензилиндол-3-илсульфонилацетат (5) Получали из 1-бензилиндол-3-илсульфонилуксусной кислоты и трис-(2-гидроксиэтил)-амина аналогично 1. Бесцветный порошок с т.пл. 109-110°С. Выход 96%. ЯМР ¹Н, в (D₃C)₂SO, (δ, м.д., J/Гц) 3.05 (т, 6Н, 3CH₂N, J=5.3); 3.63 (т, 6Н, 3СН₂ОН, J=5.3). ИК: 1560, 1600 (С=O), 2500-2720 (H⁺N), 3290(ОН). Найдено, %: С, 58.05; Н, 6.23; N, 5.87. C₂₃H₃₀N₂O₇S. Вычислено, %: С, 57.72; Н, 6.31; N,5.85.

Пример 6. Приготовление разведений стимуляторов роста для проведения исследования. В ходе испытания проводили растворение каждого потенциального стимулятора роста по следующей методике:

Растворяли 0.1 г (100 мг) вещества в 100 мл дистиллированной воды, получая 0,1% раствор, который в дальнейшем считали матричным.

Дальнейшие разведения:

Первое разведение: 0.1 мл матричного 0.1% раствора добавляли в 100 мл желточно-солевого агара (ЖСА). Концентрация препарата в среде составила 10^-4%.

Второе разведение: 0,1 мл матричного 0.1% раствора добавляем в 1000 мл ЖСА. Концентрация препарата в среде составила 10^-5%.

Третье разведение: 0.01 мл матричного 0.1% раствора добавляем в 1000 мл ЖСА. Концентрация препарата в среде составила 10^-6%.

В эксперименте используют каждое разведение препарата в питательной среде и чистую культуру возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.

Пример 7. Проведение эксперимента по выращиванию St. aureus.

Взятие и посев инфицированного материала и учет результатов производили в соответствии с регламентирующими приказами [2,6,7].

Культуры St. aureus получали путем культивирования в термостате при температуре 37°С с применением желточно-солевого агара, который готовили в соответствии с представленной инструкцией на этикетке флакона.

Для приготовления питательной среды необходимое количество сухого вещества размешивали в 1 л дистиллированной воды, кипятили в течение 3 мин до полного расплавления агара, фильтровали через ватно-марлевый фильтр, разливали в стерильные флаконы и стерилизовали автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. Среду охлаждали до температуры 45-50°С, разливали в стерильные чашки Петри слоем 3-4 мм. После застывания среды, соблюдая правила асептики, чашки подсушивали при температуре (37±1)°С в течение 40-60 мин.

Посев на чашки Петри проводили стандартным методом. Идентификацию выделенных микроорганизмов оценивали с помощью коммерческих тест-систем фирмы LACHEMA (Чехия): «STAPHYtest»

Из идентифицированной культуры St. aureus готовили взвесь 104 в физ. растворе по стандарту мутности.

Далее брали три разведения препарата в ЖСА, разливали агар по чашкам (по три чашки каждого разведения препарата в питательной среде). На чашки высевали по 0.1 мл приготовленной взвеси золотистого стафилококка и инкубировали при 37°С, просмотр чашек производили каждые 2-3 часа, отмечая рост колоний. В качестве контроля были произведены посевы на ЖСА без стимулятора роста.

Подсчет колоний, выросших на поверхности агара, производили с помощью лупы (Х5) или прибора для счета колоний. Для этого помещали чашку вверх дном на темный лист бумаги (обеспечивая тем самым лучшую видимость колоний). Для удобства каждую подсчитанную колонию отмечали со стороны дна чашки карандашом или маркером. 1 При применении стимуляторов 1-5 в среде ЖСА для ускоренного роста культур St. aureus устанавливали всхожесть микроорганизмов. Результаты ростостимулирующей активности отображены в табл.2.

Из данных, представленных в таблице 2, видны значительные различия во всхожести штаммов St. aureus на средах со стимуляторами роста разной концентрации, а также на контрольной среде ЖСА. Так, при использовании всех стимуляторов роста при концентрациях 10^-4-10^-5 вес. %, а также стимулятора №5 при концентрациях 10^-4-10^-6 вес. % через 3 часа имел место пылевидный рост микроорганизмов, через 6 часов отмечались единичные колонии, через 9 часов после высева наблюдался рост St. aureus с выраженной лецитиназной активностью. При добавлении в питательную среду стимуляторов роста 1-4 в концентрации 10^-6 вес. % через 3 и 6 часов после посева отмечался пылевидный рост микроорганизмов, через 9 часов - рост единичных колоний.

При посеве исследуемых культур на желточно-солевой агар без стимуляторов роста через 3 и 6 часов роста не отмечалось, и только через 9 часов появлялся пылевидный рост микроорганизмов. За 9 часов культивирования St. aureus в контроле не наблюдалось ни роста единичных колоний микроорганизмов, ни роста исследуемых культур с выраженной лецитиназной активностью.

Способ выращивания микроорганизмов апробирован на 24 штаммах St. aureus, выделенных от больных с гнойно-септическими осложнениями из отделения хирургического профиля с положительным результатом при осуществлении микробиологического мониторинга

Проведенные исследования позволили впервые установить, что исследованные соединения 1-5 стимулируют рост культуры St. aureus, существенно сокращая время их роста по сравнению с контролем на стандартной питательной среде (ЖСА). Эти результаты могут быть использованы для разработки усовершенствованной методики ускоренной диагностики госпитальных инфекций, вызванных S. aureus, что позволит значительно уменьшить время выдачи результата анализа и своевременно назначить адекватное лечение больного.

Литература

1. Брискин Б.С., Н. Н.Хачатрян. Внутрибольничные инфекции и их профилактика: взгляд хирурга // Хирургия: - 2005. - №2. - 26-30.

2. А.С.Лабинская, Л.П.Блинкова, А.С.Ещина, Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований // М., ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 600 с.

3. Мирскова А.Н., Мирсков Р.Г., Адамович С.Н., Воронков М.Г., Синтез и фармакологическая активность 2-гидроксиэтиламмониевых солей органилсульфанил(сульфонил) уксусных кислот - новых фармакологически активных соединений // Химия в интересах устойчивого развития. - 2011. - Т. 19. - №5. - С.467-478.

4. Мирскова А.Н., Левковская Г.Г., Ступина А.Г., Чхенкели В.А., Воронков М.Г. Влияние трис(2-гидроксиэтил)аммоний арокси-, арилтио- и арилсульфонилацетатов на жизнедеятельность бифидобактерий // Докл. АН. - 2003. - Т. 390. - №2. - С.280-282.

5. Мирскова А.Н., Левковская Г.Г., Мирсков Р.Г., Воронков М.Г. Алканоламмониевые соли органилсульфанил (сульфонил) уксусных кислот - новые стимуляторы биологических процессов // ЖОрХ. - 2008. - Т. 44. - Вып.10. - С.1501-1508.

6. Об улучшении медицинской помощи больным с гнойными хирургическими заболеваниями и усилении мероприятий по борьбе с внутрибольничными инфекциями: приказ №720 МЗ СССР. М., 1978.

7. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-диагностических учреждений: приказ №535 МЗ СССР. М., 1985.

8. Онищенко Г.Г. Национальная концепция профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. - 2011. с.21.

9. Скала Л.3., Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г. Практические аспекты современной клинической микробиологии. - М.: Лабинформ, 2004. С.64-69.

Таблица 1 Соединение Формула 1. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенил-сульфанилацетат 2. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенил-сульфонилацетат 3. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-хлорфенил-оксиацетат 4. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метил-4-хлор-фенилоксиацетат 5. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний-1-бензилиндол-3-илсульфонилацетат