СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ В ТЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза.

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) представляет собой доброкачественную опухоль, ее субстрат составляют преимущественно морфологически зрелые лимфоциты. Болезнь проявляется лимфатическим лейкоцитозом, диффузной лимфоцитарной пролиферацией в костном мозге, увеличением лимфатических узлов, селезенки и печени [1].

Течение хронического лимфолейкоза характеризуется развитием различных осложнений [2]. Наиболее частыми его осложнениями являются цитопенические синдромы, такие как анемия и тромбоцитопения. Цитопенические осложнения при ХЛЛ чаще обусловлены нарушениями иммунной системы, при которых иммунная система больного атакует и разрушает собственные клетки крови. Связь между продолжительностью жизни пациентов и цитопеническими осложнениями очевидна. При тромбоцитопении (13-15% случаев) возникают кровотечения и или кровоизлияния в головной мозг, становящихся причиной смерти больных [3].

Как свидетельствуют результаты ряда исследований, значимую роль в развитии цитопенических осложнений хронического лимфолейкоза играют генетические факторы. Среди генов-кандидатов, регулирующих, преимущественно, процессы неспецифической защиты организма, клеточной пролиферации, гемопоэза и апоптоза важное значение имеют гены интерлейкинов, в частности интерлейкин 1A и антагонист рецептора интерлейкина 1 [4].

Интерлейкин 1A или IL-1A - цитокин с широким диапазоном биологических и физиологических эффектов. Этот цитокин полифункционален и выполняет не менее 50 различных функций, мишенями которых служат клетки практически всех органов и тканей. IL-1A состоит из 271 аминокислотного остатка с молекулярной массой 17 кДа. Ген, кодирующий IL-1A, картирован на длинном плече хромосомы 2, в промоторной части которого в положении -889 находится однонуклеотидная замена (-889C/T) [5].

Антагонист рецептора интерлейкина 1 или IL-1Ra был впервые выделен из культуральной среды стимулированных моноцитов и обладал способностью ингибировать действие IL-1 на лимфоциты и фибробласты путем блокирования связывания IL-1 с клеточными рецепторами. Ген, кодирующий IL-1Ra, картирован на длинном плече хромосомы 2 в области q14. В гене IL-1Ra известен минисателлитный полиморфизм - вариабельность по числу 86-членных тандемных повторов VNTR во 2-м интроне, который предполагает существование пяти аллелей, каждому из которых соответствует определенное число повторов. Наиболее часто встречаются аллель IL-1Ra∗1, содержащий 4 повтора у 71% населения, и аллель IL-1Ra∗2, содержащий 286-членных повтора у 23% населения. Оставшиеся же аллели встречаются менее чем в 5% случаев [6].

Известен метод для диагностики и прогнозирования онкологических заболеваний, основанный на изучении соматических мутаций в гене многофункционального опухолевого супрессора (MTS) в случае неоплазий человека. Патент США №2164419, 27.03.2001. «Ген MTS, Мутации данного гена и способы диагностики злокаческтвенных опухолей с использованием последовательности гена MTS» (Мириад Дженетикс, инк. (US) и др). Изобретение относится к мутациям гена MTS в зародышевой линии и использованию данных мутаций для диагностики предрасположенности к таким формам рака, как меланома, окулярная меланома, лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина, множественная миелома, саркома, миосаркома, хлоангиосаркома, чешуеклеточная карцинома, хронический лимфойдный лимфолейкоз, а также опухоли поджелудочной железы, яичников, матки, семенников, почек, желудка, ободочной и прямой кишки. Изобретение также имеет отношение к терапии тех неоплазий человека, при которых произошла мутация в гене MTS, включая генотерапию, заменяющую белковую терапию и использование миметиков. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств диагностики и терапии опухолей.

Недостаток метода заключается в сложности анализа, его длительности и дороговизне.

За прототип выбран патент РФ №2248574 по заявке РФ №2003123171/15, 22.07.2003 «Способ прогнозирования развития и течения хронического лимфолейкоза» (Бакиров А.Б. (RU), Бакиров Б.A. (RU), где предложен способ прогнозирования развития и течения хронического лимфолейкоза, путем типирования полиморфизма ДНК лимфоцитов, выделенных из крови больного, генов TNF-alfa и TNF-beta, включающий забор периферической венозной крови, из лимфоцитов которой выделяют ДНК методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, проводят генотипирование полиморфизма промоторных областей генов TNF-^α и ^β, и при выявлении генотипа LT∗22, характеризующегося наличием мутации гена TNF-^β в гомозиготном состоянии, выявляют лиц, предрасположенных к развитию хронического лимфолейкоза, а при определении комбинаций генотипов TNF∗22/LT∗22 и TNF∗12/LT∗11 у больных хроническим лимфолейкозом прогнозируют агрессивное течение заболевания.

Недостаток прототипа заключается в том, что он не дает возможность спрогнозировать склонность больного к тромбоцитопении.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза по данным о генетических полиморфизмах -889C/T гена интерлейкина 1A и VNTR антагониста рецептора интерлейкина 1.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизмов -889C/T гена интерлейкина 1A и VNTR антагониста рецептора интерлейкина 1;

- прогнозирование развития тромбоцитопении у больных хроническим лимфолейкозом в случае выявления аллеля -889Т IL-1A и/или аллеля IL-1Ra∗1.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза по наличию аллеля -889T гена интерлейкина 1А (полиморфизм -889C/T IL-1A) и/или аллеля IL-1Ra∗1 гена антагониста рецептора интерлейкина 1 (полиморфизм VNTR IL-1Ra).

Способ осуществляют следующим образом:

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных хроническим лимфолейкозом в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон X-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°C, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (pH=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°C.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).

Изобретение характеризуется на следующих фигурах:

Фиг.1. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции гена -889 С/Т IL-1A, где цифры 2, 3, 4 - гомозиготы - 889ТТ; цифры 5, 6, 10 - гомозигота -889СС, цифры 1, 7-9, 11-14 - гетерозиготы -889СТ.

Фиг.2. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации VNTR полиморфизма IL-1Ra, где цифры 1, 2, 10-13 - гетерозиготы 2R/4R; цифры 3-7, 9, 14 - гомозиготы 4R/4R, цифра 8 - гетерозигота 2R/5R.

Фиг3. Частота аллеля -889Т IL-1A среди больных ХЛЛ в зависимости от наличия тромбоцитопении на момент обследования и в контрольной группе, %.

Фиг.4. Частота аллеля IL-1Ra∗1 среди больных ХЛЛ в зависимости от наличия тромбоцитопении на момент обследования и в контрольной группе, %.

Изучение полиморфного локуса интерлейкина 1А (-889С/Т IL-1A) проводили следующим образом. Реакция проводилась в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (pH=8,8), 1,25 мМ MgCl₂, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы.

После денатурации (3 мин при 95°C) выполняли 35 циклов амплификации по схеме: денатурация - 1 мин при 95°C; отжиг праймеров - 1 мин при 55°C; элонгация -1 мин при 72°C. Затем пробы выдерживали 5 мин при 72°C и охлаждали. После ПДРФ-анализа продукты рестрикции анализировали в 3%-ном агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, в течение 1 часа 30 минут при 80V. В качестве электрофорезного буфера использовали 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицировали в проходящем УФ-свете. Фрагменты длиной 99 пар нуклеотидов (п.н.) соответствовали аллелю -889С гена -889Т/С IL-1A, 83 и 16 п.н. - аллелю -889Т, фрагменты длиной 99, 83 и 16 п.н. наблюдались у гетерозигот -889СТ (фиг.1).

При анализе VNTR полиморфизма гена IL-1Ra реакция проводилась в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (pH=8,8), 1,25 мМ MgCl₂, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (4 мин при 95°C) выполняли 32 цикла амплификации по схеме: денатурация - 40 сек при 94°C; отжиг праймеров - 40 сек при 60°C; элонгация - 1 мин при 72°C. Затем пробы выдерживали 5 мин при 72°C и охлаждали. Продукты амплификации анализировали в 2%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в течение 30 минут при 160V. В качестве электрофорезного буфера использовали 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицировали в проходящем УФ-свете. В результате амплификации идентифицированы фрагменты ДНК длиной 240-595 п.н., с 2, 3, 4, 5 или 6 копиями тандемных повторов. Эти аллели были обозначены как 2R, 3R, 4R, 5R и 6R и соответствовали аллелям IL-1Ra 2, 3, 1, 4 и 5, соответственно (фиг.2).

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с развитием тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ2 с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI) [7].

Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза подтверждает анализ результатов наблюдений 206 больных хроническим лимфолейкозом и 307 человек популяционного контроля. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.

В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой.

Установлено, что пациенты с развившейся тромбоцитопенией на момент обследования отличаются максимальной концентрацией молекулярно-генетического маркера -889Т IL-1A (36,54%) (фиг.3), что статистически достоверно превышает показатель контрольной группы (22,77%, χ2=4,26, р=0,03, OR=1,95, 95% CI 1,03-3,67).

Аналогичной направленности данные получены и при изучении распределения аллеля IL-1Ra∗1 у пациентов с развившейся тромбоцитопенией на момент обследования (84,62%) по сравнению с контролем (70,31%, χ2=4,11, р=0,04, OR=2,32, 95% CI 1,02-5,46) (фиг.4).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что аллель -889Т гена IL-1A и аллель IL-1Ra∗1 гена антагониста рецептора интерлейкина 1 являются факторами риска развития тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза (OR=1,95 и OR=2,32, соответственно).

Применение данного способа позволит предпринять профилактические меры для предупреждения возникновения тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза, а также подобрать индивидуальную тактику ведения больного хроническим лимфолейкозом.

Литература

1. Воробьев А.И. Опухоли лимфатической системы / А.И. Воробьев, А.М. Кременецкая, Д.В. Харазишвили // Гематология и трансфузиология. - 2000. - Т.45, №3. - С.3-14.

2. Доронин В.А. Современные аспекты патогенеза и диагностики хронического лимфолейкоза: обзор лит. / В.А. Доронин // Клиническая лабораторная диагностика. - 2003. - №4. - С.24-25.

3. Никитин Е.А. Хронический лимфолейкоз / Е.А. Никитин // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. - 2009. - Т.2, №1. - С.87-91.

4. Аксенович Т.И. Картирование генов, детерминирующих распространенные болезни человека / Т.И. Аксенович // Медицинская генетика. - 2006. - Т.5, №2. - С.11-15.

5. Genetic susceptibility variants for chronic lymphocytic leukemia / S.L. Slager, L.R. Goldin, S.S. Strom [et al.] // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. - 2010. - Vol.19, №4. - P.1098-1102.

6. Ассоциации полиморфных генов интерлейкинов с иммунопатологией у телеутов / А.В. Шабалдин, А.В. Остапцева, А.Н. Глушков [и др.] // Иммунология. - 2007. - Т.28, №1. - С.3-7.

7. Боровиков В. Statistica: искусство анализа данных на компьютере / В. Боровиков. - 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.: ил. - (Для профессионалов).

8. Polymorphisms in the IL-1a and IL-1b Genes Are Not Associated with Susceptibility to Chronic Periodontitis in a Brazilian Population / P.C. Trevilatto, R.M. Scarel-Caminaga, R.B. Brito [et al.] // Braz. J. Oral. Sci. - 2003. - Vol.2, №7. - P.348-352.

9. Interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphism is associated with increased risk of epithelial ovarian cancer / J. Sehouli, A. Mustea, D. Koensgen [et al.] // Ann. Oncol. - 2003. - Vol.14, №10. - P.1501-1504.