Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ ОСНОВНОГО ПОДВИДА СРЕДНЕВЕКОВОГО И АНТИЧНОГО БИОВАРОВ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к внутривидовой дифференциации и молекулярному типированию штаммов возбудителя чумы, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях медицинского профиля и службах Роспотребнадзора.

Изобретение выполнено в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)» и в соответствии с Государственным контрактом №53-Д от 04.06.2012 г.

Чума - особо опасная инфекционная болезнь, которая и в настоящее время требует к себе пристального внимания и координированного контроля со стороны служб здравоохранения. В Российской Федерации и ближнем зарубежье существуют 45 природных очагов чумы, 11 из которых расположены на территории России. В большинстве этих природных очагов циркулируют штаммы Yersinia pestis средневекового биовара, которые относятся к основному высоковирулентному и эпидемически - значимому подвиду возбудителя чумы. Штаммы другого - античного - биовара, также относящегося к основному подвиду возбудителя чумы, имеют гораздо меньшее распространение и циркулируют в Российской Федерации лишь в одном из природных очагов Сибири, а также в ограниченном числе очагов в Киргизии, Казахстане и Монголии. Штаммы античного и средневекового биовара отличаются по биохимической активности и имеют отличия в вирулентности. Разделение штаммов этих биоваров представляет собой важную в практическом отношении задачу, поскольку выявление принадлежности исследуемых штаммов к определенному биовару позволяет проводить идентификацию штаммов по происхождению, оценивать возможные пути заноса инфекции и проводить молекулярно-эпидемиологический мониторинг штаммов Y. pestis.

В диагностических исследованиях дифференциацию штаммов Y. pestis основного подвида античного и средневекового биовара проводят по биохимическому признаку - редукции нитратов. Штаммы античного биовара активны по этому признаку, в то время как штаммы средневекового биовара неспособны к редукции нитратов. Однако проявление этого фенотипического признака может варьировать в зависимости от качества используемых сред и условий культивирования культур возбудителя. Более надежными по сравнению с фенотипическими методами анализа являются методы дифференциации, основанные на генетических свойствах, которые отличаются большей консервативностью и поэтому их применение дает более стабильные и хорошо воспроизводимые результаты. В связи с этим, важное значение имеет разработка простого и надежного способа генетической дифференциации биоваров возбудителя чумы. Применение такого метода обеспечит быстрое и эффективное разделение средневекового и античного биоваров возбудителя чумы и повысит эффективность проводимого мониторинга штаммов этого опасного возбудителя.

В настоящее время для детекции возбудителя чумы и проведения его внутривидовой дифференциации разработан ряд способов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и мультилокусном секвенировании.

Зарегистрирована тест-система, предназначенная для экспресс-диагностики возбудителя чумы методом ПЦР с набором праймеров на гены cqfl и pla, расположенные на плазмидах чумного микроба («Ген Пест» ТУ8895-005-0189). Однако эта система предназначена для детекции возбудителя чумы, но не для проведения его внутривидовой дифференциации.

Разработана другая ПЦР тест-система, использующая в качестве ДНК мишеней гены irp2, IcrV и локус "3а", которая позволяет определять видовую принадлежность штаммов Y. pestis с одновременной дифференциацией вирулентных и авирулентных штаммов, но не позволяет проводить разделения штаммов Y. pestis разных биоваров (Куклев В.Е. с соавт. Применение мультилокусной ПЦР для ускоренной идентификации Y. pestis. Сб. VI Всероссийской науч. - практ. конф. с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней». Москва, 2007; 1: 376-77).

Известен способ детекции бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных для человека видов иерсиний методом мультиплексной полимеразной цепной реакции по патенту RU 2385941, при котором идентификацию и дифференциацию патогенных видов иерсиний осуществляют путем амплификации участка гена OmpF порина Y. pestis с помощью подобранных трех пар праймеров с последующим гель-электрофорезным анализом длин амплифицированных фрагментов. Способ обеспечивает надежное разделение штаммов родственных патогенных иерсиний (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica), однако, он не предназначен для проведения внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis.

Известен способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции по патенту RU 2425891, включающий выделение ДНК из исследуемого штамма, проведение ПЦР с амплификацией фрагментов генов terC, ilvN и inv с использзованием нуклеотидных праймеров на эти гены. Способ применяют для дифференциации штаммов Y. pestis основного подвида от штаммов неосновных подвидов и штаммов Y. pseudotuberculosis.

По патенту RU 2332464 известен способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба, включающий выделение тотальной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров TAN1 и TAN2 комплементарные hutG-YP01967 области возбудителя чумы с последующим анализом специфичных ампликонов. Использование этого метода требует применения набора референтных штаммов Y. pestis, что усложняет проведение анализа и стандартизации получаемых результатов, а также способ не предусматривает разделения штаммов основного подвида по их биоварной принадлежности.

Известен способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом секвенирования по патенту RU 2404256, включающий выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции с использованием праймеров на гены жизнеобеспечения rhaS и araC, амплификацию фрагментов генов, установление их нуклеотидной последовательности и определение генотипа штамма и дифференциация штаммов путем сравнения полученного генотипа с генотипами основного и неосновных подвидов. Применение этих ДНК мишеней является достаточным для определения подвидовой (основной, алтайский, гиссарский, кавказский и улегейский подвиды) принадлежности штаммов возбудителя чумы, но не для установления их принадлежности к определенному биовару.

По патенту RU 2415948 известен «Способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного сиквенс - типирования», предусматривающий определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH, с последующей подвидовой дифференциацией путем сравнения их с последовательностями этих генов у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов. Данный способ также не дает возможности определять принадлежность штаммов Y. pestis к конкретному биовару.

Описанные способы предназначены для детекции штаммов Y. pestis, их отделения от штаммов других родственных патогенных иерсиний, а также для установления их принадлежности к определенному подвиду - основному, кавказскому, алтайскому, гиссарскому, улегейскому. Однако ни один из вышеперечисленных способов не позволяет проводить внутривидовую дифференциацию штаммов Y. pestis основного подвида по их биоварной принадлежности, что сужает их диагностические возможности и значимость для их применения в молекулярно-эпидемиологическом мониторинге возбудителя чумы. В связи с этим существует необходимость создания способа дифференциации штаммов возбудителя чумы, относящихся к различным биоварам.

Задачей изобретения является разработка простого и надежного способа дифференциации штаммов возбудителя чумы основного подвида средневекового и античного биоваров методом полимеразной цепной реакции.

Технический результат заключается в возможности эффективной и надежной дифференциации штаммов возбудителя чумы основного подвида средневекового и античного биоваров.

Технический результат достигается способом дифференциации штаммов возбудителя чумы основного подвида средневекового и античного биоваров методом полимеразной цепной реакции, включающий выделение ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции с амплификацией фрагментов хромосомной ДНК с помощью двух пар синтезированных праймеров Med (24) и Med (19), имеющих следующие последовательности:

с последующей дифференциацией штаммов, которую проводят путем сравнения размеров полученных амплифицированных фрагментов исследуемого штамма с размерами фрагментов генов, характерных для штаммов средневекового биовара 198 и 82 п.н. и для штаммов античного биовара 222 и 101 п.н.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение ДНК исследуемого штамма чумного микроба проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности».

Полимеразную цепную реакцию осуществляют по стандартной методике (МУ 1.3.1794-03) с применением вышеуказанных праймеров Med (24) и Med (19), рассчитанных на основе последовательностей штаммов чумного микроба Y. pestis KIM, Antiqua, Nepali 6, представленных в базе данных NCBI GenBank. С помощью рассчитанных праймеров проводят в ПЦР амплификацию участков хромосомы исследуемого штамма Y. pestis и определяют размеры амплифицированных фрагментов. Используемые праймеры имеют следующий состав:

Амплификацию ДНК осуществляют по следующей программе: 1 цикл 94°С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 94°С 45 сек, 56°С 1 мин, 72°С 45 сек и 1 цикл 3 мин при 72°С.

Определение размеров образованных в ПЦР фрагментов у исследуемых штаммов проводят методом электрофореза в 2% агарозном геле относительно стандарта маркеров молекулярных масс с размером от 100 до 1000 п.н.

Штаммы основного подвида возбудителя чумы средневекового биовара имеют размеры образуемых в ПЦР с помощью праймеров Med (24) и Med (19) фрагментов соответственно 198 п.н. и 82 п.н., а античного биовара - 222 и 101 п.н.

В примерах на исследуемых штаммах с неустановленной биоварной принадлежностью показана сущность изобретения.

Пример 1. Выделение ДНК исследуемого штамма проводят стандартным методом с помощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинизотиоцианата с предварительным обеззараживанием культуры путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при температуре 56°С в течение 30 мин. (Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. МУ 1.3.1794-03).

Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме 25 мкл; реакционная смесь содержит: 1х буфер (10х ПЦР-буфер - 2,5 мкл), MgCl₂ - 2,0 мМ, смесь dNTP - 0,3 мМ, оли-гонуклеотидные праймеры- 2 пмол, Taq DNA полимераза - 0,1 ед., исследуемой ДНК - 10 мкл. Продукты амплификации анализируют в 2% агарозном геле с добавлением этидиум бромида и просматривают в УФ свете.

Определяют размеры амплифицированных с помощью праймеров Med (24) и Med (19) фрагментов ДНК Они составляют 198 и 82 п.н., что соответствует размерам фрагментов генов у штаммов средневекового биовара. Исследуемый штамм №1 относят к средневековому биовару Y. pestis.

Пример 2. Выделение ДНК и условия полимеразной цепной реакции осуществляют аналогично примеру 1. Размеры образуемых в ПЦР фрагментов ДНК составляют 222 и 101 п.н., что соответствует размерам фрагментов, образуемых у штаммов античного биовара. Штамм №2 относят к античному биовару Y. pestis.

Таким образом, заявленный способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного подвида средневекового и античного биоваров методом ПЦР позволяет быстро, эффективно и надежно проводить дифференциацию штаммов Y. pestis основного подвида античного и средневекового биоваров. Использование двух ДНК мишеней, расположенных в разных участках генома возбудителя чумы повышает надежность разделения этих биоваров возбудителя чумы.