Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Escherichia coli ECD4, ОБЛАДАЮЩИЙ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К БАКТЕРИЯМ Escherichia coli СЕРОТИПА О104:Н4

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается штамма бактериофага Escherichia coli ECD4, который может быть использован для создания новых препаратов для лечения заболеваний, вызываемых бактериями Escherichia coli серотипа О104.Н4, а также для элиминации этого патогена из продуктов питания.

Некоторые штаммы бактерий вида Escherichia coli, продуцирующие шига-подобные токсины, вызывают вспышки геморрагического колита (ПС), сопровождающегося тяжелыми осложнениями в виде гемолитико-уремического синдрома (ГУС). ГУС характеризуется острой почечной недостаточностью, гемолитической анемией, тромбоцитопенией. Смертность при развитии ГУС высокая и колеблется от 3 до 30% [Hemolytic uremic syndrome and death in persons with Escherichia coli О157:H7 infection, foodborne diseases active surveillance network sites, 2000-2006 / L.H. Gould, L. Demma, T.F. Jones et al. - Clinical Infectious Diseases. - 2009. - Volume 49(10). - P. 1480].

Чаще всего от больных с ГУС выделяются энтерогеморрагические кишечные палочки (ЭОЛ) серотипа О157.Н7, которые рассматриваются, как клинически наиболее значимые, однако возбудителями спорадических случаев и вспышек заболеваний ГК все чаще становятся другие серогруппы эшерихий [Epidemiology of Escherichia coli О157:H7 outbreaks, United States, 1982-2002 / J.M.Rangel, P.H.Sparling, C. Crowe et al. - Emerging Infectious Diseases. - 2005. - Volume 11(4). - P. 134-151]. В частности, весной и летом 2011 года в Германии и других странах Европейского Союза была зафиксирована вспышка геморрагического колита с ГУС, вызванная бактериями «нового» высокопатогенного штамма Escherichia coli серотипа О104:Н4, продуцирующими шига-подобный токсин 2-го типа. Этот штамм отличается от «классических» ЭГКП по механизму адгезии и проникновения его токсина через эпителиальные клетки кишечника. Лечение геморрагического колита, вызванного эшерихиями серотипа О104:Н4, серьезно осложняется тем фактом, что клетки этого штамма обладают множественной устойчивостью к антибиотикам [Characteristics of the enteroaggregative Shiga toxin/verotoxin-producing Escherichia coli O104:H4 strain causing the outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, May to June 2011 / F.Scheutz, E.Nielsen, J.Frimodt, N.Boisen et al. - Eurosurveillance. - 2011. - Volume 16. - P. 134-145]. В связи с этим возникает необходимость разработки новых препаратов для лечения ГК, вызванного Escherichia coli серотипа О104:Н4, и элиминации этих бактерий из пищевых продуктов. В этом плане полезными могут оказаться бактериофаги.

Известен штамм бактериофага Escherichia coli V32, способный лизировать энтерогеморрагические эшерихии серогруппы О157, предложенный для идентификации бактерий данной серогруппы [Патент RU 2425877, - заявка 2010106806/10, 26.02.2010]. Однако этот фаг не способен лизировать бактерии Escherichia coli серотипа О104:Н4.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение бактериофага Escherichia coli ECD4, обладающего литической активностью по отношению к бактериям Escherichia coli серотипа О104:Н4 и пригодного для создания препарата для лечения заболеваний, вызванных бактериями Escherichia coli О104:Н4, а также для элиминации этого патогена из пищевых продуктов.

Штамм бактериофага Escherichia coli ECD4 выделен из фекалий бройлерных кур на культуре бактерий штамма Escherichia coli О104:Н4 RKI№112027 и депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером Ph 63.

Штамм бактериофага Escherichia coli ECD4 характеризуется следующими свойствами:

- морфология негативных колоний: на чувствительном бактериальном штамме формирует мутные негативные колонии диаметром около 1 мм; вторичный рост отсутствует;

- подавляет рост бактерий штамма Escherichia coli О104:Н4 RKI№112027 до восьмого десятикратного разведения при титровании по Аппельману;

- обладает литической активностью по отношению к шига-токсин-продуцирующим штаммам Escherichia coli серотипов О104:Н4 и О157:Н7, а также к клинически значимым Escherichia coli других серогрупп; кроме того, штамм бактериофага Escherichia coli ECD4 лизирует бактерии таких видов как Shigella sonnei и Shigella flexneri - возбудителей дизентерии у человека;

- не подавляет рост бактерий непатогенного для человека штамма Escherichia coli М-17, используемого для приготовления пробиотического препарата "Колибактерин";

- не содержит генов синтеза шига-подобных токсинов;

- не выявлено клонов штамма Escherichia coli О104:Н4 RKI№112027, устойчивых к бактериофагу Escherichia coli ECD4;

- геном имеет двунитевую ДНК размером около 60 тыс пар оснований. ДНК не гидролизуется ферментами SalGI, PstI, EcoRI, ВаmHI, HindIII, ApaI, KpnI, Ecol47I, Eco52I, Ecol30I, MvaI. Эндонуклеаза SmiI расщепляет ДНК штамма бактериофага Escherichia coli ECD4 на три фрагмента, два из которых имеют размер 700 и 3000 пар оснований, BcuI расщепляет ДНК на шесть фрагментов, EcoRV - на 15, XmiI - на 18, VspI - на 20 фрагментов.

- для размножения штамма бактериофага Escherichia coli ECD4 используется не содержащий генов шига-токсинов лабораторный непатогенный штамм бактерий Escherichia coli К-12 C600F, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-7158.

Штамм бактериофага Escherichia coli ECD4 хранится в виде фаголизата, либо в лиофильно высушенном состоянии.

Пример 1. Получение фаголизата штамма бактериофага Escherichia coli ECD4.

К 1 мл ночной бульонной культуры Escherichia coli К12 C600F добавляют 4 мл бульона LB (на 1 л среды 10 г триптона Bacto, 5 г дрожжевого экстракта Bacto, 10 г NaCl) и 10 мкл суспензии штамма бактериофага Escherichia coli ECD4 с концентрацией 10⁹ БОЕ/мл. Смесь инкубируют на качалке при 180 оборотах в минуту и температуре 37°С до наступления просветления бактериальной культуры, добавляют 0,5 мл хлороформа и интенсивно перемешивают в течение 20 мин. Низкоскоростным центрифугированием (10 000 g, 15 мин) удаляют обломки бактериальных клеток и титруют фаголизат методом двойных агаровых слоев. Концентрацию бактериофага выражают в количестве бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл фаголизата. В полученном фаголизате она составляет 10⁹ БОЕ/мл.

Пример 2. Проверка литической активности штамма бактериофага Escherichia coli ECD4 в отношении бактерий штамма Escherichia coli О104:Н4 RKI№112027.

Литическую активность штамма бактериофага Escherichia coli ECD4 в отношении бактерий штамма Escherichia coli О104:Н4 RKI№112027 проверяют методом Аппельмана. В пробирках, содержащих 4,5 мл бульона LB, делают последовательные десятикратные разведения штамма бактериофага Escherichia coli ECD4 и в каждую из них вносят по 5 мкл ночной бульонной культуры штамма Escherichia coli О104:Н4 RKI№112027. Кроме того, готовят две контрольные пробирки: в одной контрольной пробирке к 4,5 мл бульона LB добавляют только 5 мкл ночной бульонной культуры штамма Escherichia coli О104:Н4 RKI№112027, во второй - только 0,5 мл штамма бактериофага Escherichia coli ECD4. Пробирки инкубируют в термостате при температуре 37°С двое суток. Результат исследования оценивают визуально. Во всех пробирках до восьмого десятикратного разведения бактериофага среда остается прозрачной, также как в контрольной пробирке, содержащей только штамм бактериофага Escherichia coli ECD4. В пробирке с девятым десятикратным разведением, где концентрация бактериофага наименьшая, и в контрольной пробирке, содержащей только бактерии штамма Escherichia coli О104:Н4 RKI№112027, наблюдается помутнение среды.

Пример 3. Ферментативный гидролиз ДНК штамма бактериофага Escherichia coli ECD4.

Готовят рестрикционную смесь, содержащую 0,1 мкг/мл ДНК штамма бактериофага Escherichia coli ECD4, 1 единицу необходимого фермента и 2 мкл 10-кратного соответствующего рестрикционного буфера, деионизованную воду - до общего объема 20 мкл. Смесь инкубируют при температуре 37°С (для рестриктазы Smil - 30°С) в течение 1 часа. Электрофорез проводят в горизонтальном электрофорезном аппарате в Трис-боратном буфере при напряженности электрического поля 8-10 вольт/см в течение 1 часа. После 15 мин окрашивания в водном растворе бромистого этидия (0,4 мкг/мл) гель визуализируют под УФ-лампой. Результат ферментативного гидролиза ДНК штамма бактериофага Escherichia coli ECD4 иллюстрирует фигура 1.

Фиг.1 - Гидролиз ДНК штамма бактериофага Escherichia coli ECD4 рестрикционными эндонуклеазами BcuI (дорожка 1); SmilI(3); совместно SmiI и BcuI (4); 2 - нативная ДНК штамма бактериофага Escherichia coli ECD4; М - ДНК фага лямбда, расщепленная эндонуклеазой HindIII (маркер молекулярных масс: сверху вниз - 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 пар оснований).

Пример 4. Оценка спектра антибактериального действия штамма бактериофага Escherichia coli ECD4.

Спектр антибактериального действия штамма бактериофага Escherichia coli ECD4 определяют методом спот-теста. Для этого по 0,5 мл ночных бульонных бактериальных культур, указанных в табл.1, смешивают с 4 мл полужидкого агара (LB с 0,7% агара) при температуре 47°С и распределяют по поверхности чашки Петри, содержащей богатую питательную среду (например, Nutrient Agar, HIMEDIA). Через 20 мин на поверхность наносят каплю штамма бактериофага Escherichia coli ECD4 (10⁷ БОЕ/мл) и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. Результат исследования оценивают визуально по наличию или отсутствию пятен лизиса на газоне культуры в месте нанесения капли штамма бактериофага Escherichia coli ECD4.

* - в скобках - количество штаммов данного вида, серогруппы, серотипа, используемых при проверке;

«+» - лизис; «-» - отсутствие лизиса.

Таким образом, как видно из примеров 2 и 4, штамм бактериофага Escherichia coli ECD4 обладает литической активностью в отношении бактерий эпидемического штамма Escherichia coli О104:Н4 RKI№112027, лизирует эшерихии серотипа О157:Н7, не подавляет рост клеток непатогенного штамма Escherichia coli М-17, используемого для приготовления препарата "Колибактерин", обладает литической активностью по отношению к другим клинически значимым серогруппам эшерихий, а также некоторым видам шигелл, представленным в таблице 1. Штамм бактериофага Escherichia coli ECD4 размножается на лабораторном штамме Escherichia coli К-12 C600F, поэтому его наработка проста и не требует особых условий. Предложенный штамм бактериофага Escherichia coli ECD4 может быть использован при создании препаратов для лечения заболевания, вызываемого бактериями Escherichia coli серотипа О104:Н4, а также для элиминации их из продуктов питания.