СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ ДЛЯ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОДИГЛИКОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинским, химико-токсикологическим исследованиям, и может быть использовано при диагностике профессионального воздействия винилхлорида в лабораториях биохимии и клинико-диагностических лабораториях научно-исследовательских и медицинских учреждений.

Известны способы для количественного определения тиодигликолевой кислоты (ТДГК) в моче с использованием реакционной газожидкостной хроматографии, основанные на химической дериватизации, т.е. переводе ТДГК в более летучие соединения.

Известен способ подготовки пробы для количественного определения ТДГК в моче, предложенный китайскими учеными (Chen Z.Y. Sensitive flame-photometric-detector analysis of thiodiglycolic acid in urine as a biological monitor of vinyl chloride / Z.Y. Chen, X.R. Gu, M.Z. Cui, X.X. Zhu // Int. Arch. Occup. Environ. Health. - 1983. - Vol.82. - P.281-284). Согласно этому способу пробу мочи в объеме 1 см³ упаривают досуха, растворяют сухой остаток в смеси метанола и диэтилового эфира, проводят дериватизацию ТДГК диазометаном, пропуская последний через эфирный раствор. После завершения реакции (раствор пробы становится слегка желтым) упаривают эфирный раствор до 1 см³. Хроматографирование полученного экстракта выполняется на насадочной колонке с пламенно-фотометрическим детектированием. Предел обнаружения ТДГК в пробе мочи по данному способу составляет 0.5 мкг/см³.

Согласно способу количественного определения ТДГК в моче, предложенному тайванскими учеными (Tsun-Jen Cheng, Yu-fang Huang, Yee-Chung Ma. Urinary thiodiglycolic acid levels for vinyl chloride monomer exposed polyvinyl chloride workers // J. Occup. Environ. Med. 2001. V 43. №11. P.934-938) пробу мочи в объеме 5 см³ ТДГК экстрагируют этилацетатом с последующим центрифугированием. Полученный этилацетатный экстракт упаривают досуха и к остатку добавляют N-триметилсилилдиэтиламин в пиридине, чтобы добиться силилирования. Хроматографирование силильного производного ТДГК в полученной смеси выполняется на капиллярной колонке с масс-селективным детектированием. Предел обнаружения ТДГК в пробе мочи по данному способу составляет 1 мкг/см³.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению по технической сущности является способ подготовки пробы, описанный в статье W. Draminski, B. Trojanowska. Chromatographic determination of thiodiglycolic acid - a metabolite of vinyl chloride / Archives of Toxicology. - 1981. - Vol.48. - P.289-292. Согласно этому способу из пробы мочи в объеме 5 мл проводят 3-кратную экстракцию ТДГК этилацетатом, упаривают растворитель досуха и осуществляют дериватизацию ТДГК N-триметилсилилдиэтиламином в пиридине в силильное производное. Хроматографирование полученного экстракта выполняется на насадочной колонке с пламенно-ионизационным детектированием. Предел обнаружения ТДГК в пробе мочи по данному способу составляет 10 мкг/см³. Недостатками указанных способов являются:

1. Использование в качестве дериватизирующего реагента - очень токсичного, канцерогенного, взрывоопасного диазометана.

2. Неудовлетворительная пробоподготовка, о чем говорит предел обнаружения от 1 до 10 мкг/см³ при объеме пробы 5 см³ и использовании очень чувствительного масс-селективного детектора, а также предел обнаружения 10 мкг/см³ при использовании пламенно-ионизационного детектора.

3. Длительная и трудоемкая пробоподготовка во всех способах, использование больших количеств особо чистых растворителей: метанола, диэтилового эфира, этилацетата. Кроме того, такие детекторы как масс-селективный детектор и пламенно-фотометрический детектор доступны не во всех лабораториях по причине их высокой стоимости, по сравнению с пламенно-ионизационным детектором.

Целью настоящего изобретения является разработка менее длительного и трудоемкого способа подготовки пробы для количественного определения в моче ТДГК, позволяющего достигнуть предел обнаружения не более чем 1 мкг/см³, и использовать более доступный пламенно-ионизационный детектор.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу пробоподготовки, ТДГК дериватизируют метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты при температуре 80°C в течение 15 минут, после чего осуществляют извлечение ТДГК из пробы этилацетатом посредством жидкостно-жидкостной микроэкстракци в течение 5 минут. При этом все операции выполняют в одной емкости.

Отличительными от прототипа признаками является последовательность операций: в предлагаемом способе дериватизация предшествует экстракции; осуществление дериватизации метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты при температуре 80°C в течение 15 минут; проведение всех операций в одной емкости.

Из патентной и научно-технической литературы нам неизвестны способы количественного определения ТДГК в моче, содержащие совокупность предложенных нами признаков, что позволяет сделать вывод о новизне заявляемого технического решения. Кроме того, из существующего уровня техники нам неизвестно, что существенные признаки, характеризующие предлагаемый способ, в совокупности способны обеспечить понижение предела обнаружения ТДГК в моче до 0.5 мкг/см³.

Краткое описание чертежей

На рисунке 1 приведен график зависимости степени дериватизации ТДГК от времени при разных температурах.

На рисунке 2 приведен график зависимости степени экстракции диметилового эфира ТДГК от времени экстракции

Способ осуществляется следующим образом: в стеклянную хроматографическую виалу вместимостью 1.5 см помещают 0.36 г сульфата натрия, 0.1 см³ пробы мочи, 0.1 см³ метанола, 0.02 см³ концентрированной серной кислоты; виалу закрывают пластмассовой завинчивающей крышкой с септой и выдерживают 15 мин при температуре 80°C; после охлаждения откручивают пробку с септой, добавляют 0.5 мл этилацетата, 0.9 мл дистиллированной воды, снова закручивают виалу крышкой с септой и проводят экстракцию на мульти-вортексе в течение 5 мин. После разделения фаз виалу помещают в автоинжектор газового хроматографа, который отбирает из впалы 2 мкл верхнего органического слоя на определенной глубине и вводит в испаритель хроматографа. Хроматографирование экстракта проводят на капиллярной колонке НР-5 (30 м × 0.32 мм) в режиме линейного программирования температуры и режиме ввода пробы в капиллярную колонку "splitless". Условия хроматографирования приведены в таблице 1, а основные хроматографические параметры пика диметилового эфира ТДГК представлены в таблице 2.

Идентификация пика диметилового эфира ТДГК осуществляется по времени удерживания, полуширине пика и его симметрии, которые приведены в табл.2. Более надежная идентификация осуществляется методом сравнения-наложения двух или нескольких хроматограмм модельных смесей ТДГК в моче с разными концентрациями, а также методом сравнения-наложения хроматограммы модельной смеси ТДГК в моче и хроматограммы модельной смеси диметилового эфира ТДГК в этилацетате. Получение градуировочной зависимости осуществляется по аттестованным (модельным) смесям ТДГК моче.

Выполнение операций: внесение пробы, реактивов, дериватизация, экстракция, отбор и ввод аликвотной части экстракта в хроматограф автоинжектором в одной емкости исключает потерю реагентов и способствует повышению точности проведения анализа. В качестве емкости используется стандартная хроматографическая виала на 1.5 см³, снабженная закручивающейся крышкой с септой. С учетом объема виалы эмпирически выбраны объемы жидкой фазы и органической фазы (экстрагента), которые составляют 1 и 0.5 мл соответственно.

Использование в качестве дериватизирующего реагента метанола с серной кислотой позволяет проводить первоначально дериватизацию ТДГК в диметиловый эфир ТДГК, а затем экстракцию образовавшегося эфира.

Жидкостно-жидкостная микроэкстракция (т.е. экстракция небольшим количеством растворителя) позволяет экономить расход особо чистых растворителей.

В качестве экстрагента выбран этилацетат, который очень хорошо экстрагирует эфиры.

Экспериментальным путем получены зависимости степени дериватизации ТДГК от времени при разных температурах (рис.1), и зависимость степени экстракции диметилового эфира ТДГК от времени экстракции (рис.2).

Данные рисунки показывают, что оптимальный эффект реакции дериватизации ТДГК метанолом наблюдается при времени нагревания 15 мин и температуре 80°C, о чем говорит значение степени дериватизации 94%. Оптимальный эффект экстракции образовавшегося диметилового эфира ТДГК наблюдается при времени экстракции 5 мин, о чем говорит значение степени экстракции 87%.

Оценены метрологические характеристики способа количественного определения ТДГК в моче: повторяемость, воспроизводимость, правильность (границы неисключенной систематической погрешности) и точность (границы относительной погрешности), представленные в табл.3.

Таким образом, предлагаемый способ пробоподготовки позволяет определять ТДГК в моче с удовлетворительным пределом обнаружения и высокой точностью, использовать малый объем анализируемой пробы (0.1 см³). Применение данного способа позволяет повысить чувствительность и точность, уменьшить продолжительность анализа, упростить пробоподготовку, сэкономить расходы особо чистых веществ (этилацетат, метанол) по сравнению с аналогами. Данный способ пробоподготовки позволяет использовать пламенно-ионизационный детектор при проведении газохроматографии.