Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА, СЕКРЕТИРУЕМОГО ДРОЖЖАМИ Saccharomyces cerevisiae

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и фармакологии и касается способа получения биологического препарата медицинского назначения, а именно способа выделения и очистки рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого дрожжами Saccharomyces cerevisiae.

Гормон роста человека (соматотропин) относится к наиболее изученным гормонам гипофиза. Соматотропин является белком, молекула которого состоит из 191 аминокислотного остатка и содержит два внутримолекулярных дисульфидных мостика. Несмотря на высокую степень гомологии последовательностей гормонов роста различных млекопитающих, в клетках человека активен только собственный гормон или гормон высших приматов. Соматотропин - анаболический гормон, который необходим для постнатального роста, нормализации углеводного, липидного, азотного и минерального обмена, регенерации тканей и выживания клеток. С развитием технологий рекомбинантных ДНК стало возможным создавать микроорганизмы - продуценты биологически-активных веществ, в том числе и гормона роста человека. В настоящее время использование рекомбинантного гормона роста человека является одним из наиболее перспективных и постоянно расширяющихся направлений фармакологии.

Продуценты рекомбинантного гормона роста человека синтезируют его внутриклеточно или секретируют в среду.

Известны многочисленные способы выделения и очистки гормона роста человека, продуцируемого рекомбинантными штаммами микроорганизмов внутриклеточно. В частности, бактерии Escherichia coli образуют его в клетках в виде телец включения (RU 2099348, US 4511503, JP 4112900, CN 101665788), а другие организмы накапливают в периплазме или цитоплазме (US 6436674, EP 0974654, EP 0321940, WO 9419474).

Однако для технологии получения целевого белка использование микроорганизмов-продуцентов, секретирующих гормон предпочтительнее, так как требует меньше трудозатрат.

Способ выделения секретируемого рекомбинантного соматотропина разработан для бактерий Bacillus subtilis (Franchi E, Maisano 1991; Teresa M, Ribela 2000), а для дрожжей Pichia pastoris предложен способ очистки секретируемого рекомбинантного полигистидин-содержащего соматотропина (Calik P, Orman 2008).

Известен способ выделения из культуральной жидкости и очистки рекомбинантного соматотропина, секретируемого дрожжами Pichia pastoris (WO 2010134084), включающий двухстадийную ионообменную хроматографию на сорбентах типа SP-Sepharose FF и Toyopearl SuperQ, гидрофобную хроматографию на Toyopearl Super Butyl, фильтрацию на Сефадексе G-25 и анионную хроматографию на Toyopearl SuperQ. Суммарный выход составляет 16,8%, а чистота полученного белка - 97,8% (по данным офВЭЖХ на С4).

В качестве ближайшего аналога выбран способ выделения и очистки рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого дрожжами Saccharomyces cerevisiae (KR 960013572), включающий спиртовое осаждение целевого белка, растворение осадка в буфере с мочевиной, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-Сефарозе при pH 8, гель-фильтрацию на Сефакриле S-200 или S-300 и повторную анионообменную хроматографию на ДЭАЭ-Сефарозе при pH 7,5 (чистота препарата ≥90%).

Задача настоящего изобретения заключается в расширении арсенала способов выделения и очистки рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого дрожжами S. cerevisiae.

Задачу решают путем разработки способа выделения и очистки рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого дрожжами S.cerevisiae в процессе их ферментации в соответствующих условиях, включающего выделение целевого белка осаждением его из освобожденной от биомассы культуральной жидкости путем либо подкисления до pH 2,9-4,0, либо добавления полиэтиленгликоля, растворение полученного осадка в подходящем растворителе и предварительную очистку целевого белка либо методом анионообменной хроматографии при pH 5,6, либо методом диафильтрации в присутствии 0,1-0,5 M хлористого натрия, а также основную очистку методами анионообменной хроматографии при рН не менее 7,3 и гель-фильтрации.

Способ в общем виде

Используют штамм дрожжей S.cerevisiae, секретирующий рекомбинантный гормон роста человека в процессе ферментации в подходящих условиях. Культуральную жидкость, полученную в результате процесса ферментации, освобождают от биомассы и используют для выделения целевого белка.

Выделение целевого белка

Вариант А

Осаждение целевого белка осуществляют путем подкисления освобожденной от биомассы культуральной жидкости до рН 2,9-4,0. Осадок отделяют центрифугированием при 20 тыс. об/мин в течение 30 мин.

Вариант В

Осаждение целевого белка осуществляют путем добавления к освобожденной от биомассы культуральной жидкости раствора полиэтиленгликоля 3000-6000 Да до конечной концентрации 12-25%. Осадок отделяют центрифугированием при 20 тыс. об/мин в течение 30 мин.

Предварительная очистка

Вариант 1

Осадок, полученный по варианту А или варианту В растворяют в 50 мМ буфере Трис-HCl (pH 7,3), содержащем 0,025%-ный детергент Твин 20 (далее Буфер A), и доводят pH этого раствора до значения 5,6. Затем повторно центрифугируют при 20 тыс.об/мин в течение 30 мин для дополнительного осветления.

Очистку целевого белка осуществляют методом анионообменной хроматографии при pH 5,6. Для этого полученный раствор наносят на колонку с Q-Сефарозой (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Швеция), уравновешенную 10 мМ Трис-HCl буфером pH 5,6, содержащим 0,025%-ный детергент Твин 20, собирают фракцию, не адсорбировавшуюся на колонке, и доводят pH до 7,4-8,0. Выход целевого белка, который здесь и далее определяют методом офВЭЖХ на С18 (KR 100274191), составляет до 65% от взятого на осаждение.

Вариант 2

Осадок, полученный по варианту A или варианту B, растворяют в буфере 10 мМ Трис-HCl (pH 7,3), содержащем 0,025%-ный детергент Твин 20 (далее Буфер B).

Очистку целевого белка осуществляют методом диафильтрации. Для этого к раствору целевого белка прибавляют равный объем 0,4 М раствора хлористого натрия в 50 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,4 и концентрируют в 2 раза, используя мембрану с порогом отсечения 10 кДа. Затем в режиме диафильтрации против 10 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,4, снижают концентрацию соли в 8 раз. Выход целевого белка до 85% от взятого на осаждение.

Основная очистка целевого белка

Основную очистку целевого белка осуществляют в два этапа.

ЭТАП 1

Для основной очистки целевого белка, подвергнутого предварительной очистке по варианту 1 или 2, используют метод анионообменной хроматографии при pH не менее 7,3. Для этого раствор целевого белка наносят на колонку с Q-Сефарозой, уравновешенную буфером В. Колонку промывают исходным буфером, затем 70 мМ раствором хлористого натрия в буфере В и элюируют целевой белок 0,25 М раствором хлористого натрия в этом же буфере. Выход целевого белка на этой стадии составляет до 90% для каждого из вариантов.

ЭТАП 2

Заключительную стадию основной очистки осуществляют методом гель-фильтрации. Для этого раствор целевого белка, полученный на ЭТАПЕ 1, подвергают гель-фильтрации на колонке Супердекс G75 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Швеция), уравновешенной буфером В, содержащим 0,2 М хлористый натрий. Выход целевого белка в мажорной фракции на этой стадии составляет до 82% для любого из вариантов.

Суммарный выход целевого белка после завершения всех стадий очистки достигает 60%.

Пример 1. Выделение (вариант A) и очистка (вариант 1) рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3506

После окончания процесса ферментации клетки дрожжей отделяют центрифугированием (30 мин при 10 об/мин). К 100 мл освобожденной от биомассы культуральной жидкости (супернатанта), добавляют 20 мл 1 M лимонной кислоты до достижения рН 2,9 и выдерживают 1 ч при 5°С. Осадок отделяют центрифугированием (30 мин при 20 об/мин), растворяют при 5°С в 100 мл Буфера A и доводят до pH 5,6 с помощью 0,1 M раствора едкого натра. Затем повторно центрифугируют в тех же условиях для дополнительного осветления раствора.

Полученный раствор подвергают предварительной очистке. Для этого его наносят на колонку с Q-Сефарозой (10 мл), уравновешенную 10 мМ Трис-HCl буфером pH 5,6, содержащим 0,025%-ный детергент Твин 20. Собирают фракцию, не адсорбировавшуюся на колонке, и доводят pH до 7,4. Выход целевого белка составляет 58% от взятого на осаждение.

Основную очистку целевого белка осуществляют методом анионообменной хроматографии при pH 7,3 (ЭТАП 1). Для этого раствор белка наносят на колонку с Q-Сефарозой, уравновешенную Буфером В. Колонку промывают исходным буфером, затем 70 мМ раствором хлористого натрия в буфере В и элюируют целевой белок 0,25 M раствором хлористого натрия в этом же буфере. Выход целевого белка на этой стадии составляет 85%.

Заключительную стадию основной очистки осуществляют методом гель-фильтрации (ЭТАП 2). Для этого элюат, полученный после анионообменной хроматографии, подвергают гель-фильтрации на колонке Супердекс G75, уравновешенной буфером В, содержащим 0,2 M хлористый натрий. Выход целевого белка на этой стадии составляет 82%.

Суммарный выход целевого белка после завершения всех стадий очистки составляет 40%.

Пример 2. Выделение (вариант A) и очистка (вариант 1) рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3580

Выделение и очистку осуществляют как в примере 1, но в качестве продуцента целевого белка используют штамм S.cerevisiae ВКПМ Y-3580. Суммарный выход рекомбинантного гормона роста человека после завершения всех стадий очистки составляет 38%.

Пример 3. Выделение (вариант A) и очистка (вариант 2) рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3506

Осаждение целевого белка осуществляют как в примере 1, но образовавшийся осадок растворяют в 100 мл буфера A. Предварительную очистку осуществляют методом диафильтрации. Для этого к раствору целевого белка прибавляют равный объем 0,4 M раствора хлористого натрия в 50 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,4 и концентрируют в 2 раза в ячейке Amicon (MIllipore, США) на мембране DIAFLO РМ 10 (Amicon Corporation, США). Затем в режиме диафильтрации против 10 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,4, снижают концентрацию соли в 8 раз. Выход целевого белка в концентрате составляет 75% от взятого на осаждение. Далее осуществляют основную очистку целевого белка методом анионообменной хроматографии как описано в примере 1. Выход целевого белка на этой стадии составляет 87%. Заключительную стадию основной очистки осуществляют методом гель-фильтрации, как описано в примере 1. Выход целевого белка на этой стадии составляет 82%.

Суммарный выход целевого белка после завершения всех стадий очистки составляет 54%.

Пример 4. Выделение (вариант A) и очистка (вариант 2) рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3580

Выделение и очистку осуществляют как в примере 3, но в качестве продуцента целевого белка используют штамм S.cerevisiae ВКПМ Y-3580. Суммарный выход рекомбинантного гормона роста человека после завершения всех стадий очистки составляет 57%.

Пример 5. Выделение (вариант B) и очистка (вариант 1) рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3506

После окончания процесса ферментации клетки дрожжей отделяют центрифугированием (30 мин при 12 об/мин). Осаждение целевого белка осуществляют путем добавления раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) 3000 до конечной концентрации 25%. Для этого к 100 мл супернатанта добавляют 100 мл 50%-ного раствора ПЭГ 3000 и выдерживают 30 мин при 5°С. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием (30 мин при 20 об/мин) и растворяют в 100 мл буфера А. Дальнейшую очистку осуществляют как в примере 1.

Суммарный выход целевого белка после завершения всех стадий очистки составляет 44%.

Пример 6. Выделение (вариант B) и очистка (вариант 1) рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3580

Выделение и очистку осуществляют как в примере 5, но в качестве продуцента целевого белка используют штамм S.cerevisiae ВКПМ Y-3580. Суммарный выход рекомбинантного гормона роста человека после завершения всех стадий очистки составляет 42%.

Пример 7. Выделение (вариант B) и очистка (вариант 2) рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3506

После окончания процесса ферментации клетки дрожжей отделяют центрифугированием (30 мин при 12 об/мин). Осаждение целевого белка осуществляют путем добавления раствора ПЭГ 6000 до конечной концентрации 17%. Для этого к 100 мл супернатанта добавляют 50 мл 50%-ного раствора ПЭГ 6000 и выдерживают 30 мин при 5°С. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием (30 мин при 20 об/мин) и растворяют в 100 мл буфера A.

Очистку осуществляют как в примере 3. Суммарный выход рекомбинантного гормона роста человека после завершения всех стадий очистки составляет 60%.

Пример 8. Выделение (вариант B) и очистка (вариант 2) рекомбинантного гормона роста человека, секретируемого штаммом дрожжей S.cerevisiae ВКПМ Y-3580

Выделение и очистку осуществляют как в примере 7, но в качестве продуцента целевого белка используют штамм S. cerevisiae ВКПМ Y-3580. Суммарный выход рекомбинантного гормона роста человека после завершения всех стадий очистки составляет 58%.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получить рекомбинантный гормон роста человека с выходом до 60%, что существенно выше выхода (17%), известного для дрожжевого продуцента Pichia pastoris.

При этом чистота препарата целевого белка, полученного заявляемым способом (до 100% по методу офВЭЖХ на колонке C18) соответствует чистоте (до 100%, по методу офВЭЖХ на колонке C4) препарата, полученного с использованием дрожжевого продуцента Pichia pastoris (WO 2010134084) и превосходит чистоту продукта, полученного по способу - ближайшему аналогу (KR 960013572).

Источники информации

1. RU 2099348.

2. US 4511503.

3. JP 4112900.

4. CN 101665788.

5. US 6436674.

6. ЕР 0974654.

7. ЕР 0321940.

8. WO 9419474.

9. A new human growth hormone production process using a recombinant Bacillus subtilis strain. Elisabetta Franchi, Federico Maisano, Silvia Astrua Testori, Giuliano Galli, Salvatore Toma, Luca Parente, Francesca de Ferra, Guido Grandi, J. Biotechnology, V.18, Issues 1-2, April 1991, pages 41-54.

10. Synthesis and chromatographic purification of recombinant human pituitary hormones. Maria Teresa C.P. Ribela, Peter W. Gout, Paolo Bartolini; J. Chromatography B, V.790, Issues 1-2, pages 285-316.

11. Expression system for synthesis and purification of recombinant human growth hormone in Pichia pastoris and structural analysis by MALDI-ToF Mass Spectrometry. Calik P., Orman M.A., Celik E., Halloran S.M., Calik G., Ozdamar Т.Н., Biotechnol. Prog.; 2008 Jan-Feb; 24(1):221-6. Epub 2008 Jan 11.

12. WO 2010134084.

13. KR 960013572.

14. KR 100274191.