СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ Lactobacillus acidophilus В ЗАКВАСОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям, и может быть использовано в молокоперерабатывающей промышленности для генотипирования штаммов и культур Lactobacillus acidophilus.

Одним из способов идентификации бактерий рода Lactobacillus, кроме микробиологического, является способ с использованием ПЦР тест-системы. Осуществляется синтез генов 16S rRNA. Затем ампликоны были подвергнуты рестрикции и фрагменты ДНК были проанализированы с использованием импульсного гель-электрофореза (PFGE). Данный подход идентификации позволяет определить род лактобацил (L.L.Guan K.E.Hagen T.L.Grayson G.W. et al. / Detection of Lactobacillus Acidophilus species in the gut of chickens. // Zootecnica intemacional. - 2007. - 02 January - №35. - P.450-455).

К недостаткам данного способа можно отнести необходимость проведения анализа с использованием нескольких методик: ПЦР, гидролиз полученных ампликонов, проведение импульсного гель-электрофореза, увеличение времени тестирования бактерий, высокую его стоимость.

Наиболее близким решением выявления Lactobacillus, принятым за прототип, является способ типирования штаммов лактобацил с использованием методов полимеразной цепной реакции. Этот способ предполагает типирование изолятов лактобацил в три этапа: 1. Родовая идентификация при помощи ПЦР с праймерами на спейсерную область 16S-23S рибосомальной РНК (рРНК). 2. Видовая идентификация методом рестрикционного анализа межгенной спейсерной области 16S-23S рРНК. 3. Штаммовая дифференциация методом VNTR-анализа (variable number of tandem repeats) (A.C.Цветков, С.Н.Янов. / Использование методов полимеразной цепной реакции для видовой и штаммовой дифференциации пробиотических лактобактерий. // Сбор. научн. трудов "Фундаментальные науки и практика" с материалами Третьей Междун. телеконф. "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии" (октябрь-ноябрь 2010). Томск. - 2010. - Том 1. - №4. - раздел III. - С.98-103.

К недостаткам данного способа можно отнести необходимость проведения ПЦР, гидролиза полученных ампликонов, электрофорез, сравнения полученных паттернов каждого образца с референтными штаммами и затем проведение VNTR-анализа, что предполагает длительность процесса тестирования и высокую его стоимость.

Задачей изобретения является расширение арсенала специфических олигонуклеотидных праймеров и сокращение сроков выявления Lactobacillus acidophilus при помощи специфических синтетических олигонуклеотидных праймеров.

Поставленная задача решается тем, что синтезируются синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления Lactobacillus acidophilus в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов, согласно изобретению, праймеры имеют нуклеотидные последовательности:

Lacid1F 5'-CTCAGATAGAAAGTGGG-3' и

Lacid2R 5'-GCACACTTCTAGCCTCTGG-3'.

Задача решается тем, что в способе выявления Lactobacillus acidophilus в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов, включающем проведение ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, согласно изобретению, праймеры имеют нуклеотидную последовательность

Lacid1F 5'-CTCAGATAGAAAGTGGG-3' и

Lacid2R 5'-GCACACTTCTAGCCTCTGG-3',

а в случае выявления фрагмента ДНК размером 412 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Lactobacillus acidophilus.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Lactobacillus acidophilus в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов.

Поиск новых специфических праймеров осуществляют на основе выбранного фрагмента ДНК гена transcriptional regulator La867, характерного для Lactobacillus acidophilus, при анализе полных геномов референтных штаммов Lactobacillus acidophilus: NCFM и 30SC, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank Search.html). Выбранные фрагменты ДНК тестируют с помощью программы Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blasf).

Окончательный выбор праймеров основывается на следующих критериях: высокий уровень сходства специфического фрагмента ДНК Lactobacillus acidophilus с ДНК различных штаммов этой бактерии. Олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательности ДНК на границах специфического фрагмента с содержанием оснований GC не менее 50% и не образовывать димеры.

Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U.

Концентрацию специфических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрометрическим методом.

Таким образом, указанный способ позволяет получать синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные ДНК фрагмента гена transcriptional regulator La867, характерного только для Lactobacillus acidophilus.

Пример 2. Способ применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Lactobacillus acidophilus в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов. Способ осуществляется в несколько этапов.

Этап 1. Выделение ДНК Lactobacillus acidophilus.

Для выделения ДНК берут суспензии штаммов и изолятов Lactobacillus acidophilus, выращенных на питательном бульоне из гидролизованного молока (БГМ), а также биоматериал от кисломолочных продуктов.

При выделении из бактериальной культуры клетки осаждают в бляшку центрифугированием 2 мин при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. 50 мкл культуры добавляют к 300 мкл подогретого до +80°С 10% СТАВ, перемешивают и инкубируют при +80°С в течение 30 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,5 объема (250-300 мкл) смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), плавно перемешивают 2-3 раза в течение 1 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 13000 об/мин. Водную фазу переносят в другую пробирку и к ней приливают 300 мкл смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), перемешивают 1 мин и центрифугируют 6 мин при 13000 об/мин. К водной фазе прибавляют 40 мкл (1/10 объема) 3М ацетата натрия рН 4,8 и 1000 мкл этанола, перемешивают и помещают на 1 час при -20°С. Пробу центрифугируют 10 мин при 13000 об/мин, осадок промывают 70% этанолом, высушивают при наклонном положении пробирки при +37°С в течение 25-30 мин и растворяют в 30-50 мкл автоклавированной бидистиллированной воды.

Этап 2. Проведение полимеразной цепной реакции.

Состав реакционной смеси: Для каждой исследуемой пробы ДНК готовят ПЦР-смесь: 650 мМ трис-HCl рН 8,9; 160 мМ (NH)₄SO₄; 30 мМ MgCl; 0,5% Tvin-20; 2,5 мМ dNTP, no 0,25 мкМ каждого праймера; 1,0 е.а. Taq-ДНК полимеразы; 2 мкл пробы ДНК и автоклавированной бидистиллированной воды до 25 мкл.

Температурный режим проведения ПНР: Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов: прогревание реакционной смеси при 95°С в течение 3 мин - 1 цикл, затем денатурация при 94°С 0,2 мин, отжиг при 60°С 0,2 мин, элонгация при 72°С 0,4 мин - 40 циклов и досинтез при 72°С в течение 0,8 мин.

Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР.

Электрофорез ампликонов проводят в 0,5× трис-боратном буфере, приготовленном из 5× ТБЕ буфера (0,089 М трис-борат; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА).

Продукты ПЦР визуализировали путем электрофореза в 1%-ном геле агарозы с бромистым этидием при силе тока 40 мА в течение 25-30 мин. 12,5 мкл ампликона смешивают с 3 мкл буфера для нанесения (0,25% бромфенолового синего, 30% глицерин в бидистиллированной воде) и вносят в лунки геля под электрофорезный буфер. Электрофорез проводят при напряжении 10 в/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее 2,0-2,5 см геля (примерно 35 минут). Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».

В качестве маркера используют ДНК pBlueSK, гидролизованную Mspl (на фрагменты 710, 489, 404, 328, 242, 190 н.п.).

Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента ДНК в 412 нуклеотидных пар.

Пример 3. Определение специфичности ПЦР.

Результаты исследований по определению специфичности реакции с праймерами Lacid1F и Lacid1F представлены в таблице, которые показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют ДНК фрагмента гена transcriptional regulator La867, характерного только для Lactobacillus acidophilus. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий.

Для подтверждения специфичности тестируемого фрагмента ДНК гена transcriptional regulator La867, характерного только для Lactobacillus acidophilus, наработали фрагмент на матрице ДНК штамма Lactobacillus acidophilus La5 (Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) и провели секвенирование.

Анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых фрагментов провели методами выравнивания с другими опубликованными последовательностями полных геномов референтных штаммов Lactobacillus acidophilus: NCFM, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov./ GenBank Search.html). Установили, что рассматриваемая нуклеотидная последовательность штамма Lactobacillus acidophilus La5 (коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) совпадала с нуклеотидной последовательностью вышеназванных референтных штаммов Lactobacillus acidophilus NCFM.

Таким образом, разработанные синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК гена transcriptional regulator La867, характерного только для Lactobacillus acidophilus, обладают высокой специфичностью и позволяют эффективно проводить идентификацию штаммов и культур Lactobacillus acidophilus, используемых в заквасочных культурах молокоперерабатывающей промышленности.