СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus В ЗАКВАСОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям, и может быть использовано в молокоперерабатывающей промышленности для генотипирования штаммов и культур Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus.

До настоящего времени основным способом типирования штаммов и изолятов Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus является способ, основанный на накоплении данных бактерий в обезжиренном молоке. Так, например, при выделении культуры из исследуемого образца йогурта одну каплю продукта вносят бактериологической петлей в стерильное обезжиренное молоко. Посевы термостатируют при 37°С до свертывания молока. Изучение биологических и биохимических свойств и сопоставление полученных данных проводят с данными дифференциальных таблиц 9 и 10, приведенных в справочнике Л.А.Банниковой, Н.С.Королевой, В.Ф.Семенихиной (Микробиологические основы молочного производства. М. Агропроиздат. - 1987. - С.15-18), и таблицы 19.1 определителя микроорганизмов Берджи (Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. - Т.2. - Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уилльмса. - М.: Мир. - 1997. - С.574-576) позволяет провести типирование исследуемых бактерий.

К недостаткам данного способа можно отнести необходимость проведения большого числа биохимических дифференцирующих тестов, длительность процесса тестирования и высокую стоимость.

Наиболее близким решением данного изобретения является способ генотипирования Lactobacillus, включающий синтез олигонуклеотидных праймеров на межгенную вставку 16S-23S rRNA (Identification to the species level of Lactobacillus isolated in probiotic prospecting studies of human, animal or food origin by 16S-23S rRNA restriction profiling/ J.L.S Moreira, R.M Mota, M.F Horta et al.//BMC Microbiology. - 2005. - vol.5. - №15. - С.1-9.) Затем осуществляется синтез последовательности ДНК межгенной вставки и гидролиз ее 11 эндонуклеазами. Далее проводится электрофорез и сравнение полученных паттернов по 6 специфическим базовым точкам в сравнении с референтными штаммами. Этот прием позволяет различать почти все изолируемые культуры на уровне вида, но не подвида.

К недостаткам данного способа можно отнести необходимость проведения гидролиза ампликонов и сравнения полученных паттернов каждого образца с референтными штаммами, длительность процесса тестирования и высокую стоимость.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, является синтез с помощью ПЦР генов 16S rRNA при использовании праймеров, подобранных на основе разновидностей Lactobacillus. Это позволяет выявлять вид данных микроорганизмов и различия по отношению к другим бактериям (Е.В.Короткая, К.В.Беспоместных/ Идентификация бактерий рода Lactobacillus с использованием ПЦР-тест-системы// Сибирский вестник с.-х. науки. - 2011. - №7-8. - С.109-117).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что выявляется только род и вид Lactobacillus.

Задачей изобретения является расширение арсенала специфических олигонуклеотидных праймеров и сокращение сроков выявления Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus при помощи специфических синтетических олигонуклеотидных праймеров.

Поставленная задача решается тем, что синтезируются синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus в заквасочных культурах, используемых при производстве кисломолочных продуктов:

Lbu14F 5'-GGCCAGCCAGATCGCCAGC-3' и

Lbu15R 5'-GACCAGGTCGCTGTCCGGC-3'.

Задача решается тем, что в способе выявления Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus в заквасочных культурах при производстве кисломолочных продуктов, включающем проведение ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами, согласно изобретению праймеры имеют нуклеотидную последовательность

Lbu14F 5'-GGCCAGCCAGATCGCCAGC-3' и

Lbu15R 5'-GACCAGGTCGCTGTCCGGC-3',

а в случае выявления фрагмента ДНК размером 409 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения синтетических олигонуклеотидных праймеров

Поиск новых специфических праймеров осуществляют на основе выбранного ДНК гена mfd (transcription-repair coupling factor), характерного только для Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus, при анализе полных геномов референтных штаммов Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus: ATCC11842, ATCCBAA-365, ND02 и 2038, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank Search.html). Выбранные фрагменты ДНК тестируют с помощью программы Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Окончательный выбор праймеров основывается на следующих критериях: высокий уровень сходства фрагментов ДНК с ДНК различных штаммов Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus, содержание оснований GC не менее 50%, не образуют димеры, комплементарны последовательности ДНК на границах специфического фрагмента.

Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U.

Концентрацию специфических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрометрическим методом.

Таким образом, указанный способ позволяет получать синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные ДНК гена mfd (transcription-repair coupling factor), характерного только для Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus.

Пример 2. Способ применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus в заквасочных культурах при производстве кисломолочных продуктов

Способ осуществляется в несколько этапов

Этап 1. Выделение ДНК Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus

Для выделения ДНК берут суспензии штаммов и изолятов Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus, выделенных на среде из гидролизованного молока (ГМС), а также биоматериал от кисломолочных продуктов.

При выделении из бактериальной культуры клетки осаждают в бляшку центрифугированием 1-2 мин при 5000-7000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. 50 мкл культуры добавляют к 300 мкл подогретого до +80°С 10% СТАВ, перемешивают и инкубируют при +80°С в течение 30 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,5 объема (300-350 мкл) смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), плавно перемешивают 2-3 раза в течение 1 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 13000 об/мин. Водную фазу переносят в другую пробирку и к ней приливают 300 мкл смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), перемешивают 1 мин и центрифугируют 6 мин при 13000 об/мин. К водной фазе прибавляют 50 мкл (1/10 объема) 3М ацетата натрия рН 4,8 и 1000 мкл этанола, перемешивают и помещают на 1 час при -20°С. Пробу центрифугируют 10 мин при 13000 об/мин, осадок промывают 70% этанолом, высушивают при наклонном положении пробирки при +37°С в течение 25-30 мин и растворяют в 30-50 мкл автоклавированной бидистиллированной воды.

Этап 2. Проведение полимеразной цепной реакции

Состав реакционной смеси: Для каждой исследуемой пробы ДНК готовят ПЦР-смесь: 650 мМ трис-HCl рН 8,9; 160 мМ (NH)₄SO₄; 30 мМ MgCl; 0,5% Tvin-20; 2,5 мМ dNTP, no 0,15 мкг каждого праймера; 1,0 е.а. Taq-полимеразы; 2 мкл пробы ДНК и автоклавированной бидистиллированной воды до 25 мкл.

Температурный режим проведения ПЦР: Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов: прогревание реакционной смеси при 95°С в течение 3 мин - 1 цикл, затем денатурация при 94°С 0,2 мин, отжиг при 60°С 0,2 мин, элонгация при 72°С 0,4 мин - 35 циклов и досинтез при 72°С в течение 0,8 мин.

Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР

Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 0,5х трис-боратном буфере, приготовленном из 5х ТБЕ буфера (0,089 М трис-борат; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА).

Продукты ПЦР визуализировали путем электрофореза в 1%-ном геле агарозы с бромистым этидием при силе тока 25-40 мА в течение 30-40 мин. 12,5 мкл ампликона смешивают с 3 мкл буфера для нанесения (0,25% бромфенолового синего, 30% глицерин в бидистиллированной воде) и вносят в лунки геля под электрофорезный буфер. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее 2,0-2,5 см геля (примерно 35-40 минут). Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор». В качестве маркера используют ДНК pSKII(+), гидролизованную MspI на фрагменты 710, 489, 404, 328, 242, 190 н.п. или 100 bp. Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента ДНК в 409 н.п.

Пример 3. Определение специфичности ПЦР

Результаты исследований по определению специфичности реакции с праймерами Lbu14F и Lbu15R представлены в таблице, которые показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют ДНК фрагмента гена mfd (transcription-repair coupling factor), характерного только для Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий.

Для подтверждения специфичности тестируемого фрагмента ДНК гена mfd (transcription-repair coupling factor), характерного только для Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus, наработали фрагмент на матрице ДНК штамма 630 Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus (коллекция ГНУ СибНИИС, г.Барнаул) и провели секвенирование. Анализ нуклеотидныой последовательности синтезируемого фрагмента провели методами выравнивания с другими опубликованными последовательностями полных геномов референтных штаммов Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus: ATCC11842, ATCCBAA-365, ND02 и 2038, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank Search.html). Установили, что рассматриваемая нуклеотидная последовательность штамма 630 Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus (коллекция ГНУ СибНИИС, г.Барнаул) совпадала с нуклеотидной последовательностью, когда в качестве матрицы используют ДНК фрагмента гена GenBank вышеназванных референтных штаммов Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus.

Таким образом, разработанные синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus в заквасочных культурах при производстве кисломолочных продуктов обладают высокой специфичностью и позволяют эффективно проводить идентификацию штаммов и культур Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus, используемых в молокоперерабатывающей промышленности.