×
27.02.2013
216.012.2aa5

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА НОНА-β-(1→3)-ГЛЮКОЗИДА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ СКВАРАТНЫМ МЕТОДОМ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ синтеза конъюгата нона-β-(1→3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином (БСА) скваратным методом. Первоначально осуществляют взаимодействие нона-β-(1→3)-глюкозида с диэтилскваратом. Затем проводят реакцию полученного лиганда - моноамида скваратовой кислоты с белком БСА в смеси боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида. При этом соотношение боратного буфера и диметилсульфоксида составляет 9:1. Способ позволяет увеличить эффективность реакции конъюгации и на 20-25% снизить потребление используемого лиганда. 5 пр.
Основные результаты: Способ синтеза конъюгата нона-β-(1→3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином скваратным методом, отличающийся тем, что стадию конъюгации проводят в смеси боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида, где соотношение боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида составляет 9:1.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к области синтеза гликоконъюгатов, построенных на основе углеводных лигандов и белковых носителей. Предлагаются новые условия получения таких соединений на примере конъюгатов нона-β-(1→3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином (БСА), в которых углеводные и белковый компоненты соединены посредством скваратного линкера. Соединения такого типа в настоящее время широко используются в качестве иммуногенов и для получения вакцин против инфекционных заболеваний и рака, что позволяет расширить арсенал медицинских препаратов, используемых для лечения этих заболеваний.

Конъюгаты олиго- или полисахаридов с другой иммуногенной молекулой, такой как полипептид или белок, использовались для инициирования иммунного ответа на ряд грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также других возбудителей инфекций. Конъюгирование полисахарида или олигосахарида с полипептидом превращает иммунный ответ на олиго- или полисахарид, который обычно является Т-независимым, в Т-зависимый ответ.

В предыдущем уровне техники раскрывается как прямое, так и непрямое соединение полисахаридов с белками с образованием конъюгатов (итог подведен в ссылке [1] и патенте США №5 306 492). Методы конъюгирования включают в себя диазосочетание, тиоэфирное связывание, амидирование, восстановительное аминирование и тиокарбамоилирование для присоединения к белковому носителю.

Gever et al., Med. Microbiol. Immunol., 165: 171-288 (1979) описали получение конъюгатов некоторых капсульных полисахаридных фрагментов Klebsiella pneumoniae с нитрофенилэтиламиновым линкером путем восстановительного аминирования и присоединения производного сахара с помощью азосочетания.

В патенте США №4057685, Mclntire, описан липополисахарид Escherichia coli с пониженной токсичностью, ковалентно связанный с белковым антигеном в результате взаимодействия с галогенангидридом.

В патенте США №4 356 170, Jennings et al., описывается получение полисахарид-белковых конъюгатов методом восстановительного аминирования.

В патенте США №4673574, 4761283 и 4808700, Anderson, описано получение иммуногенных конъюгатов, включающих в себя продукт восстановительного аминирования иммуногенного фрагмента капсульного полисахарида, полученного из капсульного полимера Streptococcus pneumoniae или Н.influenzae окислительным расщеплением периодатом или гидролизом гликозидной связи и содержащего свободную альдегидную группу на восстанавливающем конце, и бактериальный токсин или анатоксин в качестве белкового носителя.

В патенте США №4459286, Hillman et al., описано получение полисахарид-белкового конъюгата путем активации полисахарида Н.influenzae типа В бромцианом, получения производного активированного полисахарида со спейсерной молекулой, 6-аминокапроновой кислотой, и присоединения основного белка внешней мембраны Neisseria meningitidis с использованием водорастворимого карбодиимида с образованием связи амидного типа с белком через сложный ряд связующих звеньев от 6-аминокапроновой кислоты до полисахарида.

В патенте США №4965338, Gordon, описано получение водорастворимого ковалентного конъюгата полисахарида с дифтерийным анатоксином, где чистый полисахарид Н. influenzae типа b активируют бромцианом и сразу смешивают с дифтерийным анатоксином, модифицированным ADH-спейсером.

В патенте США №4663160, Tsay et al., описан детоксифицированный полисахарид грамотрицательных бактерий, ковалентно связанный с детоксифицированным белком, полученным из тех же видов грамотрицательных бактерий, посредством фрагмента, имеющего 4-12 атомов углерода.

В патенте США №4619828, Gordon et al., описаны конъюгаты молекул полисахаридов патогенных бактерий, таких как Haemophilus influenzae типа b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis и Escherichia coli, с Т-зависимыми антигенами, такими как дифтерийный и столбнячный анатоксины.

В патенте США №4711779, Porro et al., описаны вакцины на основе конъюгатов гликопротеинов, обладающие трехвалентной иммуногенной активностью, содержащие антигенные детерминанты капсульных полисахаридов грамположительных бактерий, а также либо CRM197, столбнячный анатоксин, либо коклюшный токсин.

В патенте США №5306492, Porro, описан конъюгат олигосахарида с белком-носителем, полученный путем взаимодействия по реакции восстановительного аминирования олигосахарида, имеющего концевую альдегидную группу, с диаминометаном в присутствии пиридинборана, дальнейшей реакции аминированного олигосахаридного продукта с молекулой, имеющей две функциональные группы, и затем взаимодействия активированного олигосахаридного продукта с белком-носителем.

В патенте США №5192540, Kuo et al., описан конъюгат олигосахарида с белком, включающий в себя продукт восстановительного аминирования окисленного полирибозил-рибитолфосфатного фрагмента, полученного из капсульного полисахарида Haemophilus influenzae типа b, и белка внешней мембраны Haemophilus influenzae типа b.

В публикации заявки на европейский патент №ЕР 0747063 А2 описан модифицированный капсульный полисахарид, содержащий различные производные сиаловой кислоты, и гетеробифункциональную линкерную молекулу, связанную с молекулой носителя. Линкеры используются для N-алкилирования приблизительно до 5 остатков сиаловой кислоты на полисахарид. Затем оставшиеся аминогруппы ацилируют пропионовым или уксусным ангидридом.

Существует потребность в более эффективных очищенных иммуногенных олигосахарид-белковых конъюгатах, которые могут быть получены более простым способом и с более высоким выходом, для широкомасштабного получения вакцин на основе иммуногенных олигосахарид-белковых конъюгатов.

Одним из наиболее эффективных в настоящее время способов конъюгации олигосахаридов, содержащих свободную аминогруппу в агликоне, с белками является скваратный метод [2]. Так, в качестве прототипов данного изобретения могут выступать патенты США №7,722,890, Bundle, et al. и заявка на патент США №20090304734, Oscarson; Stefan; et al., в которых в качестве одного из наиболее эффективных способов конъюгирования углеводной цепи с белковым носителем также использовался скваратный метод.

Наше изобретение иллюстрируется примером получения конъюгата нона-β-(1→3)-глюкозида с белком-носителем БСА.

Целью данного изобретения является разработка эффективного способа получения иммуногенных конъюгатов нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА скваратным методом, который имеет преимущество по сравнению с применяющимися в настоящее время методологиями и приводит к продукту с расчетной степенью включения олигосахарида в конъюгат.

Техническим результатом изобретения является увеличение эффективности реакции конъюгации, снижение потребления используемого в избытке лиганда с достижением того же соотношения лиганд-БСА в конечном конъюгате, как и при проведении конъюгации без добавки диметилсульфоксида, но с использованием большего количества реагента.

Указанный технический результат достигается за счет того, что способ синтеза конъюгатов олигосахаридных лигандов с белком БСА скваратным методом, отличающийся тем, что стадия конъюгации проводится в смеси боратного буфера (рН 9.0) и диметилсульфоксида. Кроме того, в качестве олигосахарида используется нона-β-(1→3)-глюкозид. Кроме того, соотношение боратного буфера (рН 9.0) и диметилсульфоксида составляет 9:1.

Способ получения иммуногенных олигосахарид-белковых конъюгатов 5 (Схема 1) включает в себя первоначальное взаимодействие 3-аминопропилгликозида олигосахарида 1 с диэтилскваратом 2 с последующей реакцией моноамида скваратовой кислоты 3 с белком БСА 4 в боратном буфере (рН 9.0).

Предлагается способ получения конъюгатов нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА, в которых углеводные и белковый компоненты соединены посредством скваратного линкера, отличающийся тем, что реакция моноамида скваратовой кислоты 3 с белком-носителем БСА 4 проводится в смеси боратного буфера (рН 9.0) и диметилсульфоксида в соотношении 9:1 (по объему), что позволяет заметно увеличить эффективность реакции конъюгации и на 20-25% снизить потребление используемого в избытке лиганда 3 с достижением то же соотношения лиганд-БСА в конечном конъюгате 5, как и при проведении конъюгации без добавки диметилсульфоксида, но с использованием большего количества реагента 3.

При проведении конъюгации скваратсвязянного нонасахарида 3 (лиганд) с БСА 4 в обычных условиях (боратный буфер, рН 9.0) при начальном мольном соотношении лиганд - БСА 20:1 происходит включение 10 лигандов в конъюгат 5 (n=10) (здесь и далее определено методом масс-спектрометрии MALDI-TOF), то есть, не менее 50% исходного лиганда не включается и теряется (Пример 3). При снижении начального соотношения лиганд 3 - БСА 4 до 10:1 происходит пропорциональное снижение степени включения лиганда в конъюгат, то есть повысить таким образом степень конверсии лиганда 3 не удается (Пример 3). При соотношении лиганд 3 - БСА 4 16:1 степень включения лиганда составляет промежуточную величину в 7 единиц (Пример 4). Проведение конъюгации в смеси боратный буфер (рН 9.0) - ДМСО (9:1) позволяет на 20-25% снизить потребление лиганда 3 при том же соотношении лиганд-БСА в конечном конъюгате 5 (Пример 5).

Пример 1. Получение скваратного производного нонасахарида 3. К раствору исходного нона-β-(1→3)-глюкозида 1 (11,6 мг, 7,56 мкмоль) в 2 мл 50%-ого водного этанола добавляли диэтилскварат 2 (1,34 мкл, 9,07 мкмоль) и триэтиламин (1,1 мкл, 8,0 мкмоль). Полученную смесь оставляли на 2,5 часа. Затем растворитель упаривали. Остаток растворяли в 2 мл воды, раствор наносили на патрон Sep-Pak C-18, который промывали 5 мл воды, затем элюировали градиентом метанола в воде (10%→20%). Элюат упаривали, остаток лиофилизовали из воды и получили 12,2 мг (7,35 мкмоль, 97%) моноамида скваратной кислоты 3.

Пример 2. Получение конъюгата 5 нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА при мольном соотношении углеводного лиганда и белка 10:1 без добавления ДМСО. Производное 3 в количестве 6,1 мг (3,67 мкмоль, 10 экв.) и БСА 4 в количестве 22,5 мг (0,34 мкмоль) растворили в 2 мл буферного раствора (350 мкМ КНСОз и 70 мкМ Na2B4O7·10H2O, pH=9), выдерживали 6 суток при комнатной температуре. Конъюгат 3 выделяли колоночной гель-хроматографией на сефадексе G-15 в воде и лиофилизовали. Получили 20,2 мг (0,27 мкмоль, 80%) конъюгата 3 (n ~5), MS MALDI-TOF: m/z 74090.

Пример 3. Получение конъюгата 5 нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА при мольном соотношении углеводного лиганда и белка 20:1 без добавления ДМСО. Производное 3 в количестве 12,2 мг (7,35 мкмоль, 20 экв.) и БСА 4 в количестве 22,6 мг (0,341 мкмоль) растворили в 2 мл буферного раствора (350 мкМ KНСО3 и 70 мкМ Na2B4O7·10H2O, pH=9.0) и выдерживали 6 суток при комнатной температуре. Конъюгат 5 выделяли колоночной гель-хроматографией на сефадексе G-15 в воде и лиофилизовали. Получили 24,3 мг (0,29 мкмоль, 85%) конъюгата 5 (n ~10), MS MALDI-TOF: m/z 82110.

Пример 4. Получение конъюгата 5 нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА при мольном соотношении углеводного лиганда и белка 16:1 без добавления ДМСО. Производное 3 в количестве 8,5 мг (5,09 мкмоль, 16 экв.) и БСА 4 в количестве 21 мг (0,318 мкмоль) растворили в 1.8 мл буферного раствора (350 мкМ KНСО3 и 70 мкМ Na2B4O7·10H2O, pH=9), выдерживали 6 суток при комнатной температуре. Конъюгат 3 выделяли колоночной гель-хроматографией на сефадексе G-15 в воде и лиофилизовали. Получили 20,8 мг (0,21 мкмоль, 81%) конъюгата 3 (n ~7), MS MALDI-TOF: m/z 77230.

Пример 5. Получение конъюгата 5 нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА при мольном соотношении углеводного лиганда и белка 16:1 в присутствии ДМСО. Производное 3 в количестве 8,5 мг (5,09 мкмоль, 16 экв.) и БСА 4 в количестве 21 мг (0,318 мкмоль) растворили в смеси 1.8 мл буферного раствора (350 мкМ KНСО3 и 70 мкМ Na2B4O7·10H2O, pH=9) и 0,2 мл ДМСО, выдерживали 6 суток при комнатной температуре. Конъюгат 3 выделяли колоночной гель-хроматографией на сефадексе G-15 в воде и лиофилизовали. Получили 22,8 мг (0,28 мкмоль, 87%) конъюгата 3 (n ~10), MS MALDI-TOF: m/z 82150.

Источники информации

1. Dick. W.E., Jr. and M.Beurret. 1989. Glycoconjugates of bacterial carbohydrate antigens, p.48-114. In: Conjugate Vaccines Contributions to Microbiology and Immunology. J.M.Cruse and R.E.Lewis, Jr., (eds) S.Karger, Basel.

2. Chernyak, A.; Karavanov, A.; Ogawa, Y.; Kováč, P.Carbohydr. Res. 2001, 330, 479-486.

Способ синтеза конъюгата нона-β-(1→3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином скваратным методом, отличающийся тем, что стадию конъюгации проводят в смеси боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида, где соотношение боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида составляет 9:1.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 71-80 из 260.
27.07.2014
№216.012.e2d5

Способ приготовления абразивной массы для высокопористого инструмента

Изобретение относится к технологии производства абразивных инструментов из зерна электрокорунда белого на керамических связках. Способ включает дозированную загрузку и перемешивание сыпучих компонентов: абразивных зерен электрокорунда белого, керамической связки и наполнителя в виде...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002523859
Дата охранного документа: 27.07.2014
27.07.2014
№216.012.e2d9

Способ изготовления абразивного инструмента

Изобретение относится к технологии производства абразивного инструмента на керамических связках. Способ включает приготовление формовочной массы, содержащей абразивные зерна электрокорунда или карбида кремния, керамическую связку, клеящие и увлажняющие добавки и наполнитель в виде...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002523863
Дата охранного документа: 27.07.2014
10.08.2014
№216.012.e659

Пневмосистема для судна с воздушными кавернами на днище

Изобретение относится к области судостроения и касается проблемы снижения гидродинамического сопротивления водоизмещающего судна. Судно оборудовано подвижными кавернообразующими элементами, состоящими из продольных ограничительных килей правого и левого бортов, продольных промежуточных килей,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002524762
Дата охранного документа: 10.08.2014
20.08.2014
№216.012.e9ad

Стенд для измерения массы и координат центра масс изделий

Изобретение относится к области измерительной техники и может быть использовано для электрических измерений механических величин в космической технике, судостроении и авиастроении. Стенд содержит раму, к которой крепится изделие, динамометрическую платформу с установленным на ней узлом поворота...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002525629
Дата охранного документа: 20.08.2014
20.08.2014
№216.012.eaa4

Сплав на основе меди

Изобретение относится к прецизионным сплавам на основе меди для получения микро- и нанопроводов, а также тонких пленок и покрытий с отрицательным температурным коэффициентом сопротивления (ТКС). Сплав содержит, мас.%: марганец 18,0-22,0; никель 18,0-25,0; кремний 2,0-4,0; бор 1,5-4,0; германий...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002525876
Дата охранного документа: 20.08.2014
20.08.2014
№216.012.eaf1

Способ изготовления листов и плит из алюминиевых сплавов

Изобретение относится к металлургии деформируемых термически неупрочняемых алюминиевых сплавов, предназначенных для использования в качестве конструкционного материала в виде деформируемых полуфабрикатов в морской и авиакосмической технике, транспортном и химическом машиностроении, в т.ч. в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002525953
Дата охранного документа: 20.08.2014
20.08.2014
№216.012.ed19

Способ создания потока газа в гиперзвуковой аэродинамической трубе и аэродинамическая труба

Группа изобретений относится к гиперзвуковым аэродинамическим трубам (АДТ). Способ включает генерацию газа высокого давления из жидкого газа путем его газификации, регулирование давления и нагрев газа, охлаждение стенок сопла, рабочей части и диффузора, охлаждение рабочего газа в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002526505
Дата охранного документа: 20.08.2014
27.08.2014
№216.012.ee96

Способ контроля работоспособности измерительного тракта в натурных условиях и гидрофонный тракт для его реализации

Изобретения относятся к измерительной технике и метрологии и могут быть использованы для проверки работоспособности измерительных трактов (ИТ), работающих в тяжелых рабочих условиях. Техническим результатом, получаемым от внедрения изобретения, является контроль работоспособности ИТ. Данный...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002526897
Дата охранного документа: 27.08.2014
27.08.2014
№216.012.ef31

Способ изготовления высокопористого абразивного инструмента

Изобретение относится к технологии производства высокопористого абразивного инструмента на керамических связках. Способ включает приготовление формовочной массы, содержащей абразивные зерна электрокорунда или карбида кремния, керамическую связку, клеящие и увлажняющие добавки и смесь...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527052
Дата охранного документа: 27.08.2014
27.08.2014
№216.012.ef64

Способ правки шлифовального круга с выпуклым профилем с помощью алмазного ролика

Изобретение относится к области машиностроения и может быть использовано при шлифовании профильных деталей. Производят правку шлифовального круга с выпуклым профилем цилиндрической наружной поверхностью правящего алмазного ролика. Оси вращения шлифовального круга и правящего ролика скрещивают....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527103
Дата охранного документа: 27.08.2014
Показаны записи 71-80 из 193.
20.02.2014
№216.012.a2de

Выгораемое сопло комбинированного ракетно-прямоточного двигателя

Изобретение относится к машиностроению, а именно к комбинированным ракетно-прямоточным двигателям. Выгораемое сопло комбинированного ракетно-прямоточного двигателя размещено во внутренней полости сопла маршевого режима и выполнено из двух элементов, соединенных друг с другом с возможностью...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002507409
Дата охранного документа: 20.02.2014
10.03.2014
№216.012.a9bf

Износостойкий сплав для высоконагруженных узлов трения

Изобретение относится к области порошковой металлургии и предназначено для производства износостойких сплавов на основе карбонитридов титана, работающих в сложных условиях динамического нагружения, высоких контактных давлений и скоростей. Износостойкий сплав для высоконагруженных узлов трения...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002509170
Дата охранного документа: 10.03.2014
27.03.2014
№216.012.ae09

Средство для лечения эстрогензависимых опухолей

Предложено лекарственное средство для лечения эстрогензависимых опухолей. Предлагаемое средство содержит (-)-секоизоларицирезинол и вспомогательные вещества: крахмал, тальк и стеарат магния. Показано: заявленное средство вызывает значительное торможение роста аденокарциномы молочной железы, при...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002510268
Дата охранного документа: 27.03.2014
10.05.2014
№216.012.c135

Концентраторный каскадный фотопреобразователь

Изобретение относится к полупроводниковым фотопреобразователям, в частности к концентраторным каскадным солнечным фотоэлементам, которые преобразуют концентрированное солнечное излучение в электроэнергию. Концентраторный каскадный фотопреобразователь содержит подложку (1) p-Ge, в которой создан...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002515210
Дата охранного документа: 10.05.2014
10.06.2014
№216.012.cbd4

Цифровой предохранительный клапан непрямого действия с электроуправлением

Изобретение относится к области машиностроения, в частности к программируемым гидроприводам механообрабатывающего оборудования с числовым программным управлением. Цифровой предохранительный клапан непрямого действия с электроуправлением содержит основной каскад с корпусом, в последнем выполнены...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002517951
Дата охранного документа: 10.06.2014
10.06.2014
№216.012.d021

Гибридная фоточувствительная схема (гфс)

Изобретение относится к области полупроводниковой электроники и может быть использовано при создании многоспектральных и многоэлементных фотоприемников. Гибридная фоточувствительная схема содержит алмазный матричный фотоприемник (МФП), индиевые столбики и кремниевый мультиплексор с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002519052
Дата охранного документа: 10.06.2014
10.06.2014
№216.012.d13e

Коррозионностойкая высокопрочная сталь

Изобретение относится к области металлургии, а именно к коррозионно-стойким аустенитным хромоникелевым сталям, применяемым при производстве высокопрочного сортового проката. Сталь содержит компоненты при следующем соотношении, мас.%: углерод 0,01-0,1, кремний 0,5-1,0, марганец 1,0-5,0, хром...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002519337
Дата охранного документа: 10.06.2014
27.06.2014
№216.012.d6db

Топка с циркулирующим кипящим слоем

Изобретение относится к области энергетике и может быть использовано для сжигания энергетических твердых топлив низкого качества, а также в химической, нефтехимической и других отраслях промышленности. Топка с циркулирующим кипящим слоем включает камеру сгорания с устройством для ввода топлива,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002520781
Дата охранного документа: 27.06.2014
20.07.2014
№216.012.ddbc

Способ изготовления стеклокерамического материала кордиеритового состава

Изобретение относится к производству высокотермостойких керамических материалов, используемых в изделиях радиотехнического назначения. Технический результат изобретения заключается в снижении диэлектрической проницаемости и тангенса угла диэлектрических потерь. В качестве исходного сырья...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002522550
Дата охранного документа: 20.07.2014
20.07.2014
№216.012.deb0

Стенд для определения вращательных производных аэродинамических сил и моментов модели в аэродинамической трубе

Изобретение относится к экспериментальному оборудованию для определения вращательных производных аэродинамических сил и моментов модели в аэродинамической трубе, в том числе вблизи экрана. Стенд содержит модель с тензовесами, соединенную со стойкой, механизм угловых перемещений модели. Механизм...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002522794
Дата охранного документа: 20.07.2014
+ добавить свой РИД