Результат интеллектуальной деятельности: ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ B. mallei МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярной эпидемиологии и может быть использовано в медицине для обнаружения дифференцирующего фрагмента ДНК ВМА10247_А0137 в составе схемы генотипирования возбудителя сапа Burkholderia mallei как для практического здравоохранения, службы Роспотребнадзора, так и для научных исследований.

Возбудитель сапа (Burkholderia mallei) - аэробная грамотрицательная неферментирующая бактерия, принадлежащая к роду Burkholderia и относящаяся к потенциальным агентам биотерроризма группы В. Сап - особо опасная зоонозная инфекция. Необходимость исследований, направленных на генотипирование штаммов В. mallei, связана с сохранением угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций, обусловленных возникновением техногенных катастроф, природных катаклизмов, и возможных террористических актов с использованием этого возбудителя.

Генотипирование - комплексный анализ уникального для каждого живого организма генотипа на основе изучения его ДНК. Метод генотипирования на основе анализа вариабельных ампликонов (VAT - variable amplicon typing) заключается в серии полимеразных цепных реакций с праймерами, фланкирующими фрагменты уникальных ДНК-мишеней, существующих только у определенных штаммов, что позволяет проводить внутривидовую дифференциацию.

Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления целевых участков ДНК. В основе метода ПНР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных штаммов определенного вида микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генотипирования возбудителя сапа.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для определенных штаммов возбудителя сапа. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах дифференцирующего фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПНР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микроорганизмов.

Наиболее близким аналогом является схема генотипирования с использованием амплификации дифференцирующих фрагментов для возбудителя мелиоидоза, предложенная Kwanjit Duangsonk с соавторами в 2006 г. [Use of a Variable Amplicon Typing Scheme Reveals Considerable Variation in the Accessory Genomes of Isolates of Burkholderia pseudomallei, Kwanjit Duangsonk, Daniel Gal, Mark Mayo, C. Anthony Hart, Bart J. Currie and Craig Winstanley]. Для возбудителя сапа подобных исследований ранее не проводилось.

Целью настоящего изобретения является получение олигонуклеотидных праймеров для идентификации дифференцирующего фрагмента генома ВМА10247_А0137 В. mallei методом полимеразной цепной реакции.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для идентификации вариабельного фрагмента ДНК штаммов возбудителя сапа, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:

5'-GCTGCTTCGCCCACTTCG-3'-BmVAT8-Ch2s

5'-AGCATCGGATTTCATCGTCGTC-3'-BmVAT8-Ch2as

Характеристика олигонуклеотидных праймеров и участка амплифицируемой ДНК.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), были подобраны праймеры, обозначенные BMVAT8-CH2S/BMVAT8-CH2AS, комплементарные дифференцирующему фрагменту ВМА10247_А0137 для внутривидового типирования В. mallei. Расчетная длина специфического фрагмента составляет 444 п.н.

Апробация праймеров и зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителя сапа коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для обнаружения дифференцирующего фрагмента ВМА10247_А0137 ДНК возбудителя сапа методом ПЦР.

На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей четырех штаммов возбудителя сапа, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ), для конструирования праймеров был выбран фрагмент вариабельной последовательности ВМА10247_А0137, обнаруженной in silico на второй хромосоме штаммов В. mallei SAVP1, В. mallei NCTC 10247 и В. mallei ATCC 23344. В составе генома штамма В. mallei NCTC 10229 данного фрагмента обнаружено не было. Данный факт позволил рассматривать участок последовательности ВМА10247_А0137 в качестве дифференцирующего фрагмента, пригодного для генотипирования возбудителя сапа. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами - 444 п.н.

При использовании компьютерных программ была проанализирована структура выбранных пар праймеров (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров для внутривидовой дифференциации возбудителя сапа.

В состав реакционных смесей входили комплементарные специфическому фрагменту праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-полимераза. Для предупреждения испарения в процессе амплификации на мультициклере «Терцик» на поверхность смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. Для отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды. Амплификацию продолжительностью 40 циклов проводили в микроцентрифужных пробирках (0,5 мл) на мультициклере «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г. Москва) в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».

Условия проведения реакции: этап предварительной денатурации ДНК при 95°С - 5 мин, затем в течение 40 циклов - денатурация ДНК при 95°С - 10 сек; отжиг праймеров при 66°С - 10 сек; элонгация цепи при 72°С - 10 сек, с финальной полимеризацией в течение 1 мин.

Анализ продуктов ПЦР осуществляли с помощью электрофореза в 3% агарозном геле, сравнивая их подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса (рис.1). Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждалась ее положением по отношению к контрольным маркерным фрагментам (леддер 100 п.н. ДНК, ООО «Интерлабсервис», Москва) и ДНК-стандарту (ДНК, выделенная из В. mallei Ц-5 в концентрации 1×10⁵ м.к./мл).

Пример 3. Использование олигонуклеотидных праймеров BMVAT8-CH2S/BMVAT8-CH2AS в составе схемы дифференциации штаммов возбудителя сапа на музейных штаммах коллекционного центра живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Специфичность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток, выращенных на плотных питательных средах в 4 мл 0,15 М NaCl в концентрации, соответствующей 1×10⁹ м.к./мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО 42-28-85 П). Обеззараживание материала проводили в соответствии с МУ 1.3.1794-03 и МУ 3.5.5.1034-01.

Обеззараживание исследуемых проб производили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур буркхольдерий осуществляли с помощью метода нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоционата (R.Boom et al. - 1990 г). Постановку реакции ПНР осуществляли, как описано в примере 2.

При тестировании коллекции культур В. mallei Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров продукт амплификации синтезировался с ДНК следующих штаммов возбудителя сапа: В. mallei Ц-4, В. mallei Ц-5, В. mallei 8, В. mallei P-1, В. mallei Загреб, В. mallei Bogor, В. mallei Будапешт. Со штаммами В. mallei Муксувар, В. mallei 11, В. mallei V-120, В. mallei 10230, В. mallei Иванович, В. mallei 5584 и В. mallei Z-12 в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат (рис.2).

На основе анализа вариабельных ампликонов нами разработана схема генотипирования возбудителя сапа, состоящая из 9 реакций амплификации. Сочетание положительных и отрицательных результатов ПЦР формирует VAT-паттерны, уникальные для каждого штамма возбудителя сапа (рис.3А).

Таким образом, с использованием разработанных праймеров BMVAT8-CH2S/BMVAT8-CH2AS в составе схемы внутривидовой дифференциации возбудителя сапа методом VAT, удалось разделить 18 исследуемых штаммов В. mallei на 15 типов (рис.3).